翘首未来丨聚焦准确度，Oxford Nanopore 火力全开

通过之前的了解，我们已经知道Nanopore测序主要依赖于合成聚合物膜上的纳米孔，DNA/RNA链通过纳米孔时，产生电流信号，经base call可转化为碱基序列信息。从DNA/RNA链转换为碱基序列的过程中，化学试剂、测序模式、base call的准确度等方面都将影响到最终的碱基质量值（碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，质量值Q越高代表碱基被测错的概率越小）。Oxford Nanopore Technologies(以下简称ONT)公司对于这些方面也做了一系列的开发和优化。在近日的Nanopore科研团体大会（NCM2018）上，Oxford Nanopore首席技术官Clive G Brown在会上展示了ONT团队针对Nanopore测序仪用户最关心的准确性问题做出的努力及研发成果，一起来看看在提升准确度方面ONT团队到底做了哪些升级吧~

图1 Nanopore测序示意图

从R9.4.1到R10

R9.4.1版纳米孔是目前Nanopore测序通用版本，有一个纳米孔通道，一个read head。R10 是一种新型的纳米孔，其纳米孔通道更长，具有两对Reader heads（图2）。这意味着可以产生更多的碱基控制信号以达到更高的准确度。在内部测试中，以75×覆盖度，新的R10纳米孔碱基质量值可超过Q40。ONT研发团队已开始着手于R10的测试工作，并发现了其中需要提升的部分。R10试剂有望在2019年早期公开发布。

图2 R9.4.1与R10版纳米孔

新的basecaller:flip-flop

这个基于flip-flop算法的basecaller软件同时适用于R9和R10版本试剂的测序数据，使用flip-flop重新识别现有数据（R9数据），碱基质量值可达到Q37。甲基化分析也被整合到了其中，现在已经允许使用R9.4进行5mC (CpG)的识别。这个软件将在12月中旬通过Guppy软件发布。ONT公司目前正在进行R10版本的工作，预计质量值可提升至Q42。用户可以通过http://bit.ly/2Q0EApc访问新碱基识别软件。

Linear Consensus Sequencing (LCS)测序模式

Clive勾勒了一个新的名为线性一致性测序（LCS）的方法。这种方法将一条链的数条拷贝结合在一起，通过一条读长进行测序，以获得更高的准确度。LCS测序模式保留原始模板链，可检测到链上的碱基修饰信息。

图3 线性测序Linear Consensus Sequencing (LCS)

8B4文库制备方法

8B4是一种新的文库制备方法，一个提升准确性的新文库制备方法可获取更丰富的信号。ONT公司目前正在精调8B4的碱基识别和共有序列方法。

1D2建库测序方式

1D2测序模式对DNA的两条链均进行了测序（图4），在保留碱基修饰的同时，提高单碱基准确率。1D2建库测序方式的更新将单条read准确度提高到了98%。新的1D2化学试剂含有带独特识别器（unique pairing identifiers, UPIs）的连接接头，支持用于扩增子测序。

图4 1D与1D2测序

ONT的这些更新将极大地提升Nanopore测序的准确性及碱基修饰的识别能力，使Nanopore测序的应用范围更加广阔，Nanopore测序技术将在动植物基因组组装、微生物基因组、全长转录组、结构变异检测及病原菌检测等领域具备独一无二的优势。

（内容整理自OxfordNanopore微信公众号）

参考链接：
https://mp.weixin.qq.com/s/ooZbJzsuAaeQQdBnN5lozg