2022年3月20日，中南林业科技大学袁德义/张琳油茶科研创新团队，联合华中农业大学金双侠课题组等单位，在经典的国际植物学TOP期刊The Plant Journal上发表了题为“Chromosome-level genome of Camellia lanceoleosa provides a valuable resource for understanding genome evolution and self-incompatibility”的研究论文。希望组在本文章中提供了基因组测序及Hi-C测序服务！

油茶是我国重要的木本食用油料树种，在推进地方经济绿色增长、维护国家食用油安全和乡村振兴中占有十分重要的地位。茶油中不饱和脂肪酸含量达90%以上，还含有丰富的角鲨烯、维生素E、谷甾醇等物质，具有软化血管、降低血脂和血压的作用，是目前国内外最优质的植物食用油。目前，油茶主栽品种主要为多倍体的普通油茶（Camellia oleifera），由于油茶基因组大且亚基因组间的同源异源构成非常复杂，使得多倍体油茶基因组的解析非常困难，严重阻碍了油茶的分子遗传改良。狭叶油茶（Camellia lanceoleosa）是油茶组唯一的二倍体野生种，和多倍体普通油茶亲缘关系最近，破译狭叶油茶基因组不仅可以深入挖掘油茶资源中的优异性状，而且为油茶重要功能基因挖掘利用奠定了坚实基础，使得油茶育种不再是盲人摸象，从而开启了油茶分子育种育种时代。

研究团队利用三代Nanopore、二代Illumina和HIC技术，获得了狭叶油茶（2n=30）高质量染色体水平基因组。基因组大小约为3.00 Gb，杂合率高达2.2%，91.85%的序列被挂载到15条染色体上，共注释到54,172个基因。狭叶油茶重复序列占基因组的80.63%，其中转座子占比78.53%。深入分析发现，长末端反转录转座子家族长期而缓慢的扩增及在过去2百万年内的爆发式扩张，加之缺少快速有效的DNA删除机制，最终导致狭叶油茶基因组变得庞大。狭叶油茶与茶叶均为山茶科山茶属二倍体植物。比较基因组研究发现，狭叶油茶与茶叶共享最近的一次WGD事件，并在6-7百万年前发生分化，2号和11号染色体在狭叶油茶与茶叶间存在较大的倒位，这可能是油茶和茶叶在基因组结构上的一个重要变异。

图1 狭叶油茶基因组的组装

图2 狭叶油茶转座子的插入与移除

图3 狭叶油茶比较基因组分析

基于狭叶油茶基因组，结合GC_MS以及转录组分析，发现油脂合成的关键基因ACC的扩张及DGAT、GPD、SAD在种子的偏向性表达是狭叶油茶高油脂和高油酸含量的重要原因。儿茶素、茶氨酸、咖啡碱是茶叶品质的重要组成成分，基于UPLC-MS/MS技术的代谢组检测到狭叶油茶叶片也富含儿茶素和茶氨酸，而咖啡碱主要富集在种皮和根中，多组学分析结果表明，SAM-dependent N-methyltransferases与咖啡碱的积累与分布密切相关。细胞学分析显示，狭叶油茶也是后期自交不亲和植物。结合亲和性相关基因的表达、结构特征及染色体定位，解析了狭叶油茶的自交不亲和性特征。狭叶油茶的油脂含量、脂肪酸比例以及次生代谢物分布与含量都与普通油茶类似，以上性状的解析为理解普通油茶油脂合成等重要经济性状的形成与调控提供了重要参考。

图4 狭叶油茶自交不亲和特征解析

中南林业科技大学龚文芳副教授、肖诗鑫讲师及在读硕士生王林凯为论文共同第一作者，中南林业科技大学袁德义教授、张琳教授和华中农业大学金双侠教授为论文共同通讯作者，黄冈师范学院朱华国教授、胡孝明教授及中国农业科学院农业基因组研究所廖振阳博士后也参与了本项研究。本研究得到了国家重点研发计划项目（2018YFD1000603）、湖南省自然科学基金（2020JJ5968）的联合资助。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/tpj.15739

近日，中国科学院成都生物研究所李家堂研究团队等以云南西双版纳地区的“飞蛙”——黑蹼树蛙为研究对象，通过多维度研究手段，阐明了其攀爬和滑翔行为相关表型的遗传机制。相关研究在《美国科学院院刊》以封面论文形式发表。希望组在本研究中提供了三代测序组装、注释以及Hi-C测序、挂载服务。

动物复杂性状是动物长期适应演化的结果，是动物多样性形成的重要基础。自然界物种采取各种各样的进化策略以适应不同的栖息地，如高原、海洋、荒漠等。部分类群通过演化出了特殊的表型以适应树栖生活。树栖生活拓展了这些物种对垂直空间资源的利用，有助于它们躲避天敌，获取丰富的食物资源等。但森林环境复杂的立体结构也对动物的运动能力提出了严苛的要求。

在白垩纪末期大规模物种灭绝事件后，无尾目多个科的物种独立演化出了攀爬和滑翔的相关表型，并成功拓殖树栖生态位，黑蹼树蛙就是其中的代表性物种。黑蹼树蛙隶属于树蛙科，常年生活在热带雨林树冠层，是典型的树栖蛙类。据报道，其最高栖息高度达57米，为目前树栖蛙类停留高度的最高记录。黑蹼树蛙具有强大的滑翔能力，因此又被称为“飞蛙”，为揭开两栖动物树栖适应之谜提供了良好的动物模型。

两种树蛙形态学比较与行为学实验

两种树蛙蝌蚪发育时期的肢体形态学比较提示两者之间存在不同的发育模式。以两种树蛙高质量基因组为基础，结合蝌蚪四肢发育过程中的转录组数据，通过时序基因共表达网络分析，发现黑蹼树蛙蝌蚪肢体在发育阶段特异共表达一系列与Wnt信号通路和血管重构相关的基因。这种发育时期特异表达模式可能通过参与指和指间区域生长速率的调控对蹼足的形成起到关键作用。

两种树蛙蝌蚪肢体发育过程形态学比较与时序基因共表达网络分析

树蛙中调控角蛋白和细胞骨架形成的PPL基因受到正选择，且存在树蛙属内保守的氨基酸替换，这可能有助于树蛙攀爬相关性状——吸盘的形成。壁虎的刚毛主要由β角蛋白扩张形成，而树蛙指/趾尖吸盘的主要结构蛋白为α角蛋白，而α角蛋白同样是哺乳动物和人类毛发纤维最主要的成分之一。

“这些祖先角蛋白可能在早期四足动物需要皮肤强化的区域中表达，而随后分化为支持两栖动物和哺乳动物不同的适应性结构”。

本研究通过前期大量的野外观察，整合形态学、行为学和组学等学科研究手段，系统解析了“飞蛙”滑翔的遗传机制，为人类认识动物有趣行为提供新的视角，对动物特殊功能的仿生研究及人类并指症等相关疾病的防治有重要基础科学价值。

该研究成果以“Genomic adaptations for arboreal locomotion in Asian flying treefrogs”为题在《美国科学院院刊》以封面论文形式发表（点击左下角阅读原文）。本研究得到中国科学院B类先导科技专项、国家自然科学基金等项目的资助。

基因组完成图一直以来都是组学研究领域的前沿，近期发表的人类X染色体完成图和8号染色图完成图极大地推动了人们对基因组完成图的认知及研究。近日，T2T联盟（端粒到端粒联盟小组）研究人员几乎同时在bioRxiv杂志上公开3篇文章，宣布完成首个无gap的人类基因组完成图，并首次解锁了基因组完成图级别的结构变异和表观遗传。这些研究成果将会成为人类测序史上里程碑事件！下面跟着组学君一起学习下这3篇文章吧。

The complete sequence of a human genome

2001年，Celera Genomics和国际人类基因组测序联盟公布了人类基因组草图，自此掀起了基因组学的一场革命。这些草图和随后更新的基因组序列，尽管有效地覆盖了基因组全染色质部分，但异染色质区域以及许多复杂区域仍然未能测通或者存在错误序列。为了解决这悬而未决的8%基因组部分，T2T联盟（染色体端粒到端粒联盟）开始了相关工作，完成了首个真正完整人类基因组测序，共计30.55亿bp的人类基因组序列。这是自人类参考基因组首次发表以来至今，最大的飞跃。新的T2T-CHM13参考基因组包括了所有22条常染色体和x染色体的无GAP组装，纠正了许多错误序列，并引入了近2亿bp（即200Mb）的新序列，其中包含有2,226个同源基因拷贝序列以及115个蛋白质编码区域。最新完成的区域还包含所有着丝粒卫星阵列（centromeric satellite arrays）以及所有5个端粒染色体（acrocentric chromosomes）的短臂区域。首次解锁的这些基因组复杂区域，以便于进行结构变异以及功能相关的研究。

在过去6年的时间里，研究者们采用了多种技术对CHM13进行测序，包括了30x PacBio CCS（HiFi）测序，120x Oxford Nanopore ultra-long测序，100x Illumina PCR-Free测序，70x Hi-C测序，以及Bionano光学图谱和Strand-seq。为了更好的利用这些数据集，研究者们开发了新的组装、校正以及验证的方法。和T2T联盟组装出的第一个X染色体（依赖于ONT测序reads搭建骨干，之后利用其它技术进行校正）相比，研究者们采用了新的组装策略，综合利用HiFi reads的准确性和读取长度，完成了高度重复着丝粒卫星阵列以及密切相关的重复片段的组装。

T2T-CHM13人类完整基因组序列与GRCh38的比较

T2T-CHM13v1.1组装包括了22条人类常染色体和x染色体的端粒到端粒的无GAP组装，由3,054,815,472bp的核DNA和16,569bp的线粒体基因组组成（CHM13没有Y染色体）。和GRCh38相比，这个完整组装的参考序列增加或修正了238Mb的序列。该序列的大部分是由着丝粒卫星序列（180Mb）、重复片段（68Mb）和rDNAs（10Mb）组成，表明在着丝粒和重复片段确定区域之间存在重叠。在这些区域中有182Mb的序列是首次发现，因此对CHM13组装而言是全新区域。最终发现T2T-CHM13v1.1组装版本显著增加了人类基因组中的已知基因数目和重复序列数量。T2T-CHM13共注释出63,494个基因和233,615个转录本，其中有19,969个基因和86,245个转录本预测为蛋白质编码区域。

Segmental duplications and their variation in a complete human genome

大片段复制（segmental duplications，以下简称SDs）在人类疾病和进化中具有重要意义；但由于其结构的复杂性，这些高度相同的大片段重复（SDs）是人类参考基因组（GRCh38）中最后完成的区域之一。基于完整的 T2T人类基因组(T2T-CHM13)，研究者们呈现了一个综合的人类SD结构组织。在染色体级别的scaffolds中鉴定了218Mbp的SDs，其中1/3(81.3 Mbp)的SDs为新发现的或其结构与GRCh38中是不同的，将人类基因组片段复制的占比预估值从5.4%提高到了7.0%，发现近端着丝粒染色体的63%（35.11/55.7Mbp）由SDs组成，且SDs长度比其他SDs长1.75倍（p=0.00034）。使用DupMasker对所有T2T-CHM13 SDs进行注释，鉴定了30个在T2T-CHM13和GRCh38之间拷贝数变化最大的复制子，而这也是基因注释最有可能改变的区域，然后，研究者们集中关注了这30个SDs结构组织的验证，将来自人类fosmid基因组文库（25）的可用末端序列数据比对到T2T-CHM13组装结果中选择合适的探针以确认高同一性（>95%）SDs的模式，结果显示所有30个基于T2T-CHM13预测的SDs都得到了验证。与独特区域相比，SDs有更丰富的单核苷酸变异多样性，而基于T2T-CHM13和GRCh38参考基因组的高质量和单倍型性质，研究者分析比较了全基因组模式的单核苷酸变异，同时基于GRCh38 and T2T-CHM13的共有区域，研究者预估了unique regions 的单核苷酸变异（SNV）密度为0.95SNVs/kbp，而当加上SDs区域时，密度上升为1.47 SNVs/kbp，这50%的增加可能是因为SDs突变率的增加（例如，由于中间基因转换的作用），或是重复序列的平均聚合程度加深。此外，研究者关注了重复基因转录相关的甲基化特征，发现SD区块通常作为一个整体被甲基化或非甲基化，分析预测了182个新的蛋白质编码候选基因，其中许多代表扩张的串联重复（例如，X染色体上的GAGE基因家族成员）或大的散布重复（例如，β-防御素基因座），将几乎相同的基因的额外拷贝添加到人类基因组中。比较了其他人类（n=12）和非人灵长类（n=5）基因组的长读长组装结果，使用T2T-CHM13基因组系统地重建了在人类额叶皮质扩张中重要的生物医学相关（LPA、SMN）和重复基因（TBC1D3、SRGAP2C、ARHGAP11B）的进化和结构单倍型多样性。此项研究揭示了人类及其近亲在SD结构中前所未有的结构杂合度模式和巨大的进化差异。

T2T-CHM13和GRCh38中SD的统计

T2T-CHM13基因组中的SD占比

Epigenetic Patterns in a Complete Human Genome

人类第一个端粒到端粒基因组T2T-CHM13的完成，使人们能够探索完整的表观基因组，消除之前参考序列缺失所带来的限制。现有的表观遗传研究忽略了未组装和无法定位的基因组区域(如着丝粒、着丝粒附近、端粒臂、亚端粒、片段重复、串联重复)。利用人的基因组完成图，我们能够通过k-mer辅助绘图方法测量表观遗传标记的富集。这使得阵列级富集信息能来表征这些卫星重复的表观遗传调控。利用Nanopore测序数据，我们生成了迄今为止最完整的人类甲基化基因组。我们分析了卫星DNA的甲基化模式，并揭示了沿单个分子有序的甲基化模式。在探索着丝粒表观基因组时，我们发现了一个与着丝粒组装的活性位点一致的着丝粒甲基化的显著下降。并且发现低甲基化区域极其难以接近，并与CENP-A/B结合配对。利用长读长，我们研究了复杂的大卫星阵列(如X染色体失活)中特异等位基因的大范围表观遗传模式。利用单分子测序，可以基于甲基化状态区分表观遗传异质性和均质区来聚类。该研究应用长读长和短读长技术为表观遗传调控提供了新的见解，为研究人类基因组最难以捉摸的区域提供了一个框架。

 

2001年人类基因组计划完成，使人们不仅能够了解编码序列，而且能够了解基因组的其他部分如何通过表观基因组调控基因表达。但表观基因组只能通过生成人类基因组的完整基因组才有机会来探索最后的前沿——基因组的重复区域。在T2T-CHM13中，绝大多数新序列位于着丝粒间、着丝粒和端中心区域(+180.5 Mb)和片段重复区域(+44.2 Mb)。基因组的表观遗传调控不仅控制基因表达，而且通过调控异染色质提供基因组的稳定性。

长读长生成人类染色体完全甲基化图谱

利用T2T-CHM13基因组，我们已经开始探索新完整区域的表观基因组。通过k-mer辅助制图，我们利用现有的短读数据来探索重复阵列水平的表观遗传图景。为了检测重复区域，我们应用Nanopore的长读长表观遗传学分析。与合成测序策略不同，Nanopore测序直接探测DNA,可以同时测序碱基序列和表观遗传状态，长读长提供了对单个分子表观遗传模式的更深入的了解。结合T2T-CHM13组装和来自同一CHM13细胞系的超长读长CpG甲基化数据，我们生成了迄今为止最完整的人类甲基化组。染色体臂上的着丝粒卫星和大卫星的高分辨率甲基化图谱揭示了这些区域的新机制和表观遗传特征。纳米孔测序的单分子读取特性允许进一步了解表观遗传细胞间的异质性和单倍型甲基化。随着对完整基因组组装的大规模改进和超长Nanopore数据的可定位性的结合，研究大范围卫星阵列的表观遗传调控在技术上成为可能，并可揭示新的机制和调控事件。

2021.03.01,Nature Communications杂志在线发表题为“Single-molecule long-read sequencing reveals a conserved intact long RNA profile in sperm”的研究论文，由美国罗切斯特大学李鑫团队与爱荷华大学（现俄亥俄州立大学）区健辉团队合作发表。该研究利用三代测序技术检测了精子细胞中完整的 long RNAs（spiRNAs），在小鼠和人类精子中分别检测到了3440和4100种 spiRNAs。结果显示，这些spiRNAs种类上包含mRNA和long non-coding RNAs，进化上spiRNA在小鼠和人类之间是相对保守的，并且在编码核糖体的mRNAs中显示富集。该研究描述的完整long RNAs图谱为进一步研究其生物成因和功能提供了基础，同时本研究中的策略和自主开发的生物信息分析流程为其它类型样本完整longRNAs鉴定提供了参考。希望组提供了本次研究的部分三代测序服务。

文章题目：Single-molecule long-read sequencing reveals a conserved intact long RNA profile in sperm
发表期刊：Nature Communications
发表时间：2021.03.01
影响因子：12.121
测序技术：Pacbio Iso-Seq、Illumina、Nanopore cDNA全长转录组

主要研究结果

1.小鼠精子中存在完整的long RNAs且与精巢中的有明显不同

 

本研究证实了小鼠精子存在完整的 long RNA，共检测到了来自1,624个基因位点的3,440 种spiRNA ，其中有755种spiRNA和参考序列中已报道过的完全相同，198种spiRNA的基因位点是全新的，7种spiRNA是已知基因位点的反义链(图2a)，2479种为已注释位点的新转录本(图2b），研究发现这些新转录本大多由APAs作用产生而来，只有少部分是由可变剪切和选择性转录起始产生（图2c)。此外检测到了1个跨越两个邻近基因的spiRNA（图2d)。与精巢中的完整转录本不同，spiRNA 长度更短（963nt)且有特异性功能富集，基于GO富集分析，spiRNA最显著富集之一的是编码80S核糖体的mRNAs（图4a），而这在精子成熟过程中是不需要的，说明spiRNAs具有组织特异性。

图2：精子中存在完整的long RNA转录本.

2. spiRNAs包含mRNAs和lncRNAs

为了验证spiRNAs在精子发生发生过程中的编码潜力，研究者们结合已有的Ribo-Seq数据库分析后，将小鼠的spiRNAs分成了2343个mRNAs和1097个lncRNAs，RPFs（ribosome protected fragments）在spi-mRNAs的编码区富集（图3a），并且发现在spi-mRNAs上富集的RPFs呈现出了三核苷酸的周期性 （three-nucleotide periodicity）（图3b）。此外该研究还验证了新转录本的潜在编码功能，来自已知位点的共2479个新isoforms中有1538个被注释为mRNAs， RPFs也分布在新的外显子序列中（图3c），这说明spi-mRNAs中的RPFs是可以进行翻译的。而对于来自新位点的198个新转录本，研究者们观察到78个已经注释的mRNAs和120个lncRNAs（图3d,e）之间存在明显差异，这种现象和全转录本中相似（图3a,b）。

图3 spiRNAs include both mRNAs and lncRNAs

3.小鼠与人类之间的spiRNA profile在进化上是保守的

为了检测spiRNA在进化上的保守性，研究者们同时还对人类精子RNA进行了测序 （图5），分析后共检测到2205个基因位点中的4,100 spiRNAs ，包括3517个mRNAs和583个lncRNAs。对比发现小鼠和人类共有562个spiRNAs相同（图4c)。以所有人类spiRNA genes 作为背景进行GO富集分析，结果显示编码蛋白质合成的mRNAs得到了富集（图4d)，与在小鼠精子中的发现一致（图4a)。研究者们进一步分析了非核糖体mRNAs，发现小鼠和人类依然存在明显的重叠。说明可能存在一种保守机制决定spiRNAs序列库。

 

图4  The spiRNA profile is evolutionarily conserved

 

 图5 Diverse transcripts in human sperm

总结与讨论

这项研究证明了精子中存在完整的 long RNAs，并在编码核糖体蛋白功能中显示富集，其功能与精巢中的RNAs不同，说明其具有一定的组织特异性。而另外发现的spiRNA在小鼠和人类中具有保守性，说明可能存在一种潜在的保守机制决定着spiRNAs序列库。

总之，该研究结合自助开发的研究策略和生物信息分析流程，揭示精子细胞中的完整RNA图谱，推动了RNA介导的表观遗传学研究，并为该领域进一步的研究提供了宝贵资源。