生物医学研究已经步入大数据和大科学时代。一方面，多组学数据分析已成为生命科学前沿领域最重要的研究工具之一，多维度数据挖掘与整合分析，可以帮助科学家实现从基因组到表型组、贯穿微观和宏观尺度的系统分析，极大提高了人类解读复杂生命系统的能力，对更加深刻、精准地破解肿瘤、遗传病等各类疾病的发病原因与微观机制，寻找更有效的干预手段奠定了重要基础。另一方面，要破解人类健康、生命起源等重大科学问题，需要进行全球合作，开展分布式的国际大科学计划。然而，没有高质量的数据生成、高可靠的数据分析与整合以及全球科学界一致认可的统一标准，多组学数据分析研究就失去了稳固的“地基”，全球范围的生命科学国际大科学计划也将无从谈起。如何解决类似的难题？研发国际科学界广泛认可的多组学标准物质至关重要。

北京时间2023年9月7日晚，国际学术期刊《自然·生物技术》（Nature Biotechnology）在线发表了由复旦大学/上海国际人类表型组研究院石乐明、郑媛婷团队联合中国计量科学研究院方向、董莲华团队，国家卫健委临床检验中心李金明、张瑞团队共同研发的全球首套多组学标准物质“中华家系1号”的最新研究成果。同期刊发的2篇科研论文分别聚焦：“使用基于中华家系1号标准物质的相对定量进行多组学数据整合（Multi-omics data integration using ratio-based quantitative profiling with Quartet reference materials）”和“中华家系1号 RNA标准物质与基于比值的分析方法提高了转录组数据的质量（Quartet RNA reference materials and ratio-based profiling for assessing and improving the quality of transcriptomic data）”。这也标志着中国科学界自主研制、获批为“国家一级标准物质”的“中华家系1号（Quartet）”多组学标准物质的研发和效用得到了国际同行的认可，开创了生物医学“度量衡”新体系，将提升生命科学创新的源头质量，为全球推进人类表型组计划奠定坚实的标准基础。

标准物质是高质量生物医学创新研究的“标尺”与“砝码”

在生命科学研究中，针对相同研究样本在不同平台、不同实验室、不同批次所产生的组学数据往往存在“批次效应”，导致不可重复数据和错误结论，严重影响科研结果的可信度与质量。而现实生活中，类似“批次效应”的危害更大：在临床检验中，同一个指标在不同的医院检验结果会出现差别，这种数据差别一旦过大甚至会导致错误的临床治疗决策，耽误疾病的预防和诊治。

要解决批次效应这一影响生命科学与生物医学多组学研究源头质量的“拦路虎”，就必须研发相应的标准物质。标准物质是指具有足够均匀性和稳定特性的物质，可作为生物分析研究的“标尺”与“砝码”。在生物医学研究中，标准物质可用于评估不同实验室、不同平台、不同批次的数据质量，有助于排除实验条件和技术差异带来的误差，确保数据的一致性和可靠性。而多组学研究的普及，亟需科学界研发多组学标准物质。

统一的标准是生命科学领域国际大科学计划全面推进的关键基础

由于测量和研究的对象涉及到人类自身，因此生命科学领域的大科学计划与其他学科领域存在显著差别。分布式，即在不同大洲和国家各自实施，而不是集中式地开展研究是生命科学领域国际大科学计划的主要组织模式。这就对相关大科学计划在科研和实施过程中所参照的标准和质量控制提出了极高的要求。基于公认的基准——标准物质，统一相关研究的测量标准和数据标准，使得全球不同实验室针对同一类研究的数据可以参比，是生命科学领域能够实质性开展大科学计划的重要前提和基础。

作为人类基因组计划之后，生命科学领域的下一个战略制高点和重大科学计划，人类表型组计划在规划之初就把研发标准物质和统一全球科研标准作为重中之重。在国家和上海市支持下，中国相关科研团队在人类表型组的精密测量、标准物质研发、质量控制、数据处理等各个方面在全球范围内率先开发和制定相关SOPs、标准和质控体系，并通过国际和中国两大协作组网络，推动协同全球不同地区的实验室在同一标准下开展表型测量与研究。

相关团队已经完成了对2万余种表型开展测量的质控标准研发与SOP编制工作。2021年10月，由石乐明教授牵头起草的国际标准ISO/TS 22690:2021 《基因组信息学 高通量基因表达数据可靠性评估》（Genomics informatics—Reliability assessment criteria for high throughput gene—expression data）发布。该标准规定了高通量基因表达数据的可靠性评估标准，适用于基因芯片、新一代测序的基因表达数据的准确性、复现性、可比性的评估应用。同年10月，在上海市市场监督管理局的指导下，“上海市标准化创新中心（国际人类表型组）”获批成立，成为上海市首批6家新型标准化技术组织单位之一，正在全面引领国内外人类表型组标准化研究与创新。

此次“中华家系1号”多组学标准物质最新研究成果的国际发表，是中国科学家引领人类表型组计划实质性推进所作出的又一里程碑式的贡献。可以说，在人类表型组科研质量控制与标准体系构建中取得的一系列先发优势，进一步奠定了中国科学界在人类表型组计划中的引领地位。希望组为本研究提供三代测序和分析服务。

“二十年磨一剑”，打造全球首个多组学标准物质

图1：“中华家系1号”（Quartet）多组学标准物质

图2：国家一级标准物质证书（GBW 099000-GBW 099007）

在“中华家系1号”的研制过程中，研究团队通过在国内32个研究中心运用24种主流技术平台对标准物质进行了深入全面的表征，获得了包括基因组、表观基因组、转录组、蛋白组和代谢组在内的多组学大数据。在此基础上，研究团队提出了一系列质量控制指标，构建了高置信的标准数据集，为多组学技术、实验室性能、分析算法的评估提供了高质量的“基准真值”。

据悉，基于“中华家系1号”DNA和RNA标准物质，国家卫生健康委临床检验中心已于2021年和2022年分别开展了全外显子测序和转录组测序的全国科研与临床实验室的室间质评研究，参加单位超过100 家，并将逐步开展表观基因组、蛋白质组、代谢组等多组学室间质评，以促进我国科研和临床实验室多组学检测数据质量的不断提升。

据石乐明教授、郑媛婷副教授介绍，在严格遵守我国人类遗传资源管理条例并获得国家批准的基础上，上海国际人类表型组研究院和复旦大学大力推动“中华家系1号”多组学标准物质走向全球，已经在国内外100多家单位进行了广泛应用，扩大了中国标准物质的国际影响力。例如，欧洲转化医学研究先进基础设施（European Advanced Translational Research Infrastructure in Medicine (EATRIS) Plus）已经采用“中华家系1号”多组学标准物质对EATRIS-Plus联盟的多家单位在多组学数据产生和数据分析方面的性能进行客观评估。欧方正与上海国际人类表型组研究院等中国代表性机构共同探索、积极推动构建多组学生物数据质量的国际标准。

未来的生物医学研究中，多组学分析是一个贯穿基因型到表型的整合过程，从数据生成和数据整合程序的每个环节都会影响最终结果。因此，必须对每种组学数据从样品到结果的完整流程进行全面能力验证和质量控制。

本次发表的最新成果证明：“中华家系1号”不仅具有天然的家系关系，样本之间微小的内在生物学差异可为数据整合提供高灵敏度的可靠性评估。此外，这些基于同一来源细胞系制备的多组学标准物质包含了从DNA到RNA再到蛋白质的信息流，遵循中心法则，可用于验证整合结果是否反映跨组学分子间的逻辑关系。

在传统的基于组学标准物质的质量控制中，通常将标准数据集视为“金标准”。然而，这些数据集只能评估高置信基因组区域中的变异和稳定检出的高表达分子特征，并且受到构建时采用的技术平台和分析方法的限制，不适用于对新技术的质量评估。本研究提出了不依赖标准数据集而仅基于家系个体间生物学关系的质量评估参数：对于定量组学数据，信噪比（Signal-to-Noise Ratio，SNR）可用于评估测量系统能否识别不同样本组之间的固有生物学差异，这是转录组等定量组学分析的基本目标；对于定性组学数据，同卵双胞胎之间胚系变异的一致率和家系个体间孟德尔符合率，可以实现在全基因组范围内对变异检测准确性的客观、无偏好的质量评估。通过与标准数据集的联合使用，多组学数据的质量控制体系更加完善，为各类新兴技术的质量评估提供了可能。希望组为本研究提供三代测序和分析服务。

图3：信噪比（SNR）

本次的研究成果最终提出了多组学分析的质量控制指标和整合的最佳实践建议：

多组学分析在生物医学研究中具有广泛的应用前景，为了确保结果的准确、可靠、可重复，研究人员需要遵循质量控制和最佳实践建议。这一研究为多组学领域的规范化、标准化发展奠定了坚实基础，指明了提高多组学分析质量和可信度的重要途径，对促进多组学研究的高水平、高质量发展具有重要意义。

图4：Quartet多组学项目概览

RNA测序（RNA-seq）是转录组差异分析的常用技术，广泛应用于生物医学研究中，以发现临床诊断、预后和治疗的生物标志物。随着基于转录组的生物标志物发现成果不断涌现，RNA-seq技术将逐步成为临床常规检测项目，例如通过检测差异基因表达辅助临床治疗决策。这对RNA-seq的检测结果提出更高的可靠性要求，以提高疾病亚型间较小的差异表达的能力，提高临床差异表达的检测准确性。

在本次发表的论文“中华家系1号”RNA标准物质与基于比值的分析方法提高了转录组数据的质量”中，研究团队指出，RNA标准物质是评估RNA-seq数据可靠性的宝贵工具，可在实验室批次内有效性和跨批次可重复性两方面对其可靠性进行客观评估。批次内有效性是在相同批次或实验室内的分析结果达到技术所能够达到的最佳水平，而跨批次可重复性是不同平台、实验室或批次间分析结果可重复，并且不受批次效应影响，跨批次数据整合后的结果与单批次结果可重复。“中华家系1号”RNA标准物质，具有微小的样本间差异、高度稳定性、长期可用性和易于生产性等特性，可用于临床应用场景下的能力测试和方法验证。

研究团队整合了不同文库构建策略、不同实验室、时间生成的21个批次RNA-seq数据集，在全转录组水平构建了基于比值的标准数据集，提供了跨平台和跨实验室数据评估的“基准”。此外，研究团队发现“中华家系1号”样本之间微小的内在生物学差异可为跨批次的RNA-seq数据整合提供高灵敏度的可靠性评估。该研究表明“中华家系1号”RNA标准物质和标准数据集，可作为评估和提高临床和生物学领域中转录组数据质量的独特资源。

图5：Quartet RNA标准物质项目：以MQAC Sample A/B样本为参照，证明了”中华家系1号”样本间具有微小的固有生物学差异

在此次发表的2篇最新论文中，中国团队取得一个重要理论性突破，那就是发现和揭示了绝对特征定量是多组学测量和数据整合不可重复性的根源，证实了基于标准物质的比值相对定量可以有效提升数据整合的质量。这对推动从绝对定量向相对定量的范式转变，实现大规模多组学数据的有效整合利用，具有重要的里程碑意义。

不同批次和平台的绝对定量多组学数据存在较大技术变异，主要受批次效应影响，无法有效反映样本间的真实生物学差异，导致数据整合效果较差。为解决此问题，研究提出一种基于比值的相对定量策略：在每个批次内使用相同标准物质作为参照，将样本的特征表达水平转换为相对于标准物质在该特征上表达的比值。

这种相对定量方法可以显著减少技术变异，提高不同批次数据之间的可比性。基于这种相对定量数据，批次效应大幅减弱，样本分类和特征关联的识别准确性显著提高，能更好反映样本间的生物学差异。特别地，主流算法难以有效校正不平衡设计下的批次效应，而相对定量方法可以有效解决。

Multi-omics data integration using ratio-based quantitative profiling with Quartet reference materials

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-023-01934-1

复旦大学石乐明教授、中国计量科学研究院方向研究员、国家卫生健康委临床检验中心李金明研究员、复旦大学丁琛教授、郑媛婷副教授为本论文共同通讯作者。复旦大学郑媛婷副教授、刘雅晴、杨竞成博士、中国计量科学研究院董莲华研究员、国家卫生健康委临床检验中心张瑞研究员，以及复旦大学田莎博士为本论文共同第一作者。

Quartet RNA reference materials and ratio-based profiling for assessing and improving the quality of transcriptomic data

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-023-01867-9

复旦大学郑媛婷副教授、石乐明教授、国家卫生健康委临床检验中心张瑞研究员、复旦大学钱峰副研究员和美国FDA Joshua Xu博士为本论文共同通讯作者，复旦大学郁颖青年副研究员、侯湾湾博士、刘雅晴、王海燕博士，以及中国计量科学研究院董莲华研究员为本论文共同第一作者。

相关研究得到科技部战略性国际科技创新合作重点专项“人类表型组学数据的质量控制与标准化研究”和上海市市级科技重大专项“国际人类表型组计划”资助。研究所涉及的样本和国际合作均已获得国家人类遗传资源管理部门批准，相关数据开放获取已在国家人类遗传资源管理部门备案。

目前已知发表的最大的两个基因组: 南极磷虾(48G)和肺鱼(40G)的基因组组装都是由NextDenovo参与协助完成的。NextDenovo软件是由希望组自主研发的三代测序基因组组装工具，在极大减少计算资源和运行时间的情况下，仍然能够组装出高质量基因组，具有高纠错、高效组装、高准确度的优势，已帮助众多科研人员进行基因组的组装以及文章的发表。

（一）The enormous repetitive Antarctic krill genome reveals environmental adaptations and population insights

磷虾是磷虾属的软体甲壳类动物，是所有海洋生态系统的重要组成部分。南极磷虾（Euphausia superba）的生物量为3-5亿吨，是地球上最大的野生动物物种。磷虾基因组估计为42–48Gb，其庞大的基因组规模和复杂性阻碍了它的组装，并阻碍了对南极磷虾适应性遗传基础的研究。2023年3月2日，国际顶级期刊Cell上发表题为“The enormous repetitive Antarctic krill genome reveals environmental adaptations and population insights”的研究论文，揭示了南极磷虾适应南大洋的基因组基础，并为未来的南极研究提供了宝贵的资源。武汉希望组为本研究提供基因组组装服务，武汉希望组首席生信技术官胡江为共同作者。

发表期刊：Cell (IF：66.85)

研究对象：南极磷虾

主要测序技术：Hi-C、PacBio

主要完成单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、青岛华大基因研究院、德国阿尔弗雷德•魏格纳研究所、澳大利亚联邦科学与工业研究组织等机构

希望组贡献：提供NextDenovo组装技术支持

部分研究结果

01染色体水平基因组组装和评估

研究者利用PacBio、Hi-C结合短读长对南极磷虾（图1A）进行测序，使用NextDenovo v2.30 (https://github.com/Nextomics/NextDenovo)组装了48.01Gb的基因组，这是迄今为止报道的最大的动物基因组组装。它比墨西哥蝾螈大约大50%，比两种肺鱼大20%-30%。与120个已经组装的无脊椎动物基因组相比，该组装具有更长的contig N50（178.99kb）（图1B），scaffold N50更是达到了1.08Gb。南极磷虾基因组中的重复DNA异常丰富，使得基因组组装特别具有挑战性。研究发现，基因组组装中含有很大比例的串联重复(TRs)(25.77%)，因为TRs很难组装，特别是对于长度大于50bp和高丰度的TRs（图1C）。南极磷虾基因组的重复区密度高于墨西哥蝾螈、肺鱼和两种孔雀石甲壳类动物（图1D）。该基因组组装结果表明，巨大的南极磷虾基因组可以归因于重复序列扩增。72.15%的基因组序列被鉴定为重复序列，在附加重复注释后达到92.45%，略高于报道的澳大利亚肺鱼（90.00%）（图1E）。南极磷虾、凡纳滨对虾和弗吉尼亚磷虾之间的DNA/CMC- EnSpm系统发育树显示，南极磷虾中没有显著扩张的特定分支（图1F）。

图1 南极磷虾基因组图谱及其重复序列特征

02南极磷虾环境适应的基因组基础

南极磷虾与其他真核生物一样，能够产生自我维持的昼夜节律（反馈回路）。这些包括主要的时钟抑制剂PER、TIM和CRY2以及直接调节CLK和CYC表达的三个关键昼夜节律转录因子VRI、PDP1和REV-ERB。该发现提供了磷虾生物钟的分子结构模型，证实了双反馈回路机制可能存在。进一步评估了生物节律反馈回路中基因表达的季节性差异，揭示了四个昼夜节律基因（CLK、CRY1、NEMO和PDP1）在夏季和冬季之间的差异表达。CLK、CRY1和PDP1在夏季上调，而NEMO在冬季上调（图2A）。研究者在南极磷虾基因组中发现了25个显著扩增的基因家族（图2B）。12个直接参与蜕皮周期（6个家族）和能量代谢（6个家族）（图2C）。这些家族中的大多数基因都有表达，表明额外的基因拷贝具有功能（图2D）。编码卵黄蛋白(VTG)是无脊椎动物中一种重要的蛋黄蛋白，在能量需求旺盛的产卵季节提供营养库,包括CYSC、PFK和PKLR在内的其他能量代谢相关基因在夏季也表现出上调（图2F），PNLIPRP2的两个同源基因之一(一种消化脂肪酶基因)在冬季上调，此外，促进蜕皮和生长的基因(JHE、JHE-like CXE和CHT10)在食物供应量高的夏季上调，而抑制蜕皮的基因(JHAMT和CASP2)在冬季上调(图2F)。

图2 适应南极海洋环境的潜在基因组变化

该研究的主要技术亮点是组装有史以来最大的动物基因组，基因组中超丰富的TR DNA加剧了这一技术挑战，成为主要的生物学发现之一。该发现揭示了南极磷虾适应南大洋的基因组基础，并为未来的南极研究提供了宝贵的资源。

（二）African lungfish genome sheds light on the vertebrate water-to-land transition

肺鱼是现存最接近四足动物的近亲，并保留了由水生向陆生过渡相关的祖先特征。现存的6种肺鱼，有4种生活在非洲，1种生活在南美，还有1种生活在澳大利亚。2个不同的研究团队分别以非洲肺鱼和澳洲肺鱼为研究对象在国际顶级期刊Cell和Nature上发表了研究成果。肺鱼基因组是迄今为止报道的最大的动物基因组（约40Gb），基因组中大量的重复序列（＞60%）进一步增加组装的难度，希望组凭借领先的ONT Ultra long测序和自主开发的NextDenovo基因组组装技术分别助力两研究团队完成了高水平的基因组组装，其中，为非洲肺鱼文章提供了Nanopore测序和NextDenovo、NextPolish软件的使用，使得该超大基因组的BUSCO评估达到95%以上，武汉希望组生物科技有限公司胡江为本文的共同第一作者。

图3 非洲肺鱼

发表期刊：Cell (IF：66.85)

研究对象：非洲肺鱼

主要测序技术：Nanopore1D、BioNano和Hi-C

主要完成单位：西北工业大学生态与环境学院、中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室、中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室等

第一作者：王堃、王俊、朱成龙、杨连东，任彦栋、阮珏、范广益、胡江（希望组）

希望组贡献：提供基因组测序和NextDenovo、NextPolish软件及组装技术支持

部分研究结果

01非洲肺鱼染色体基因组组装、重复序列与进化分析

研究团队利用Nanopore Ultra long、BioNano和Hi-C测序，采用NextDenovo + wtdbg2 + NextPolish策略组装，最终获得约40.05 Gb的基因组，Contig N50达到1.60 Mb；结合BioNano和Hi-C数据对基因组构建Scaffold和辅助染色体挂载，最终得到17条染色体，Scaffold N50 2.81 Gb，染色体挂载率达到99%以上。BUSCO评估显示该基因组包含了95%以上的脊椎动物完整基因。非洲肺鱼基因组如此巨大主要是由TEs的扩张引起的，非洲肺鱼基因组的61.7%（24.7 Gb）被注释为重复序列。研究团队通过分析Kimura distance估算了TE历史扩张活动，结果表明TEs，特别是反转录转座子，在过去7000万年中一直活跃。基于基因组组装和注释结果，通过对8种脊椎动物的5149个单拷贝基因进行系统发育重建，证实非洲肺鱼是与四足动物最近的姐妹谱系，非洲肺鱼和四足动物的分化时间可追溯到泥盆纪伊始，估算为419 MA。

图4 非洲肺鱼染色体水平基因组组装和进化史

02 基因改变增强了呼吸能力

肺呼吸能力的进化可能经历了三个步骤：第一步是硬骨鱼的共同祖先已具备了最初级的呼吸空气的能力（已有文献支持），本研究中检测到所有硬骨鱼中存在Sftpb同样也证实这一观点。第二步是通过诸如Sftpc的出现和邻近Foxp1的保守非编码元件（CNEs）等基因创新，肉鳍鱼类的共同祖先获得了增强空气呼吸的能力。第三步可能是进一步的基因创新，包括Sftpa、Sftpd的出现以及Foxp2附近保守非编码元件（CNEs）的出现，为四足动物进化出呼吸系统提供了最后的关键基础。

图5 肉鳍鱼类肺呼吸功能的演变

希望组作为三代测序行业的引领者，拥有完备的三代测序平台，强大的生物信息团队，拥有自主研发且在基因组组装领域被广泛应用的NextDenovo系列算法。已为众多科研院所提供优质的测序及分析服务，积累了丰富的项目经验。

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磷虾是磷虾属的软体甲壳类动物，是所有海洋生态系统的重要组成部分。南极磷虾（Euphausia superba）的生物量为3-5亿吨，是地球上最大的野生动物物种。磷虾基因组估计为42–48Gb，其庞大的基因组规模和复杂性阻碍了它的组装，并阻碍了对南极磷虾适应性遗传基础的研究。然而，最近对肺鱼和墨西哥蝾螈的研究表明，大型动物基因组组装中固有的巨大技术挑战是可以克服的。

3月2日，国际顶级期刊Cell上发表题为“The enormous repetitive Antarctic krill genome reveals environmental adaptations and population insights”的研究论文，揭示了南极磷虾适应南大洋的基因组基础，并为未来的南极研究提供了宝贵的资源。武汉希望组为本研究提供基因组组装服务，武汉希望组首席生信技术官胡江为共同作者。

目前已知发表的最大的两个基因组: 南极磷虾(48G)和肺鱼(40G)的基因组组装都是由NextDenovo参与协助完成的。NextDenovo软件是由希望组自主研发的三代测序基因组组装工具，在极大减少计算资源和运行时间的情况下，仍然能够组装出高质量基因组，具有高纠错、高效组装、高准确度的优势，已帮助众多科研人员进行基因组的组装以及文章的发表。

部分研究结果

01. 染色体水平基因组组装和评估

研究者利用PacBio、Hi-C结合短读长对南极磷虾（图1A）进行测序，使用NextDenovo v2.30 (https://github.com/Nextomics/NextDenovo)组装了48.01Gb的基因组，这是迄今为止报道的最大的动物基因组组装。它比墨西哥蝾螈大约大50%，比两种肺鱼大20%-30%。与120个已经组装的无脊椎动物基因组相比，该组装具有更长的contig N50（178.99kb）（图1B），scaffold N50更是达到了1.08Gb。南极磷虾基因组中的重复DNA异常丰富，使得基因组组装特别具有挑战性。研究发现，基因组组装中含有很大比例的串联重复(TRs)(25.77%)，因为TRs很难组装，特别是对于长度大于50bp和高丰度的TRs（图1C）。南极磷虾基因组的重复区密度高于墨西哥蝾螈、肺鱼和两种孔雀石甲壳类动物（图1D）。该基因组组装结果表明，巨大的南极磷虾基因组可以归因于重复序列扩增。72.15%的基因组序列被鉴定为重复序列，在附加重复注释后达到92.45%，略高于报道的澳大利亚肺鱼（90.00%）（图1E）。南极磷虾、凡纳滨对虾和弗吉尼亚磷虾之间的DNA/CMC- EnSpm系统发育树显示，南极磷虾中没有显著扩张的特定分支（图1F）。

图1 南极磷虾基因组图谱及其重复序列特征

02. 南极磷虾环境适应的基因组基础

南极磷虾与其他真核生物一样，能够产生自我维持的昼夜节律（反馈回路）。这些包括主要的时钟抑制剂PER、TIM和CRY2以及直接调节CLK和CYC表达的三个关键昼夜节律转录因子VRI、PDP1和REV-ERB。该发现提供了磷虾生物钟的分子结构模型，证实了双反馈回路机制可能存在。进一步评估了生物节律反馈回路中基因表达的季节性差异，揭示了四个昼夜节律基因（CLK、CRY1、NEMO和PDP1）在夏季和冬季之间的差异表达。CLK、CRY1和PDP1在夏季上调，而NEMO在冬季上调（图2A）。研究者在南极磷虾基因组中发现了25个显著扩增的基因家族（图2B）。12个直接参与蜕皮周期（6个家族）和能量代谢（6个家族）（图2C）。这些家族中的大多数基因都有表达，表明额外的基因拷贝具有功能（图2D）。编码卵黄蛋白(VTG)是无脊椎动物中一种重要的蛋黄蛋白，在能量需求旺盛的产卵季节提供营养库,包括CYSC、PFK和PKLR在内的其他能量代谢相关基因在夏季也表现出上调（图2F），PNLIPRP2的两个同源基因之一(一种消化脂肪酶基因)在冬季上调，此外，促进蜕皮和生长的基因(JHE、JHE-like CXE和CHT10)在食物供应量高的夏季上调，而抑制蜕皮的基因(JHAMT和CASP2)在冬季上调(图2F)。

图2 适应南极海洋环境的潜在基因组变化

03. 南极磷虾种群动态

研究者在大西洋区南乔治亚岛(SG)和南设得兰岛(SSI)、印度洋区Prydz湾(PB)和太平洋区罗斯海(RS)四个生物量较高的南大洋区域收集了75只磷虾，并对其进行了平均深度为17.72X的基因组测序（图3A）。研究者观察到南极磷虾地理组之间的成对FST值较低，最大群体遗传多样性指数(Fst)为1.92×10-3（图3B），然而，PCA（图3C）、MDS和NJ表明，南极磷虾的遗传结构是可识别的，特别是在SG和PB-RS之间。环境隔离（IBE）分析表明，遗传分化与环境距离显著相关（图3D）。387个自适应SNP的等位基因频率揭示了SGSSI和PB-RS组之间的不同遗传模式（图3E）。该结果表明，环境选择可能在驱动南极磷虾不同群体的遗传结构中发挥重要作用。研究者使用PSMC和PopSizeABC推断过去的有效种群规模（Ne），发现Ne从大约1千万年前急剧减少，种群规模的总体峰值约为1千万年，还观察到南极磷虾群从10万年前开始扩张（图3F）。磷虾的栖息地可能会转移到高纬度地区，但气候变化将如何影响磷虾种群规模，进而影响依赖磷虾的南极生态系统，是迫切需要解决的关键问题。

图3 南极磷虾种群动态

该研究的主要技术亮点是组装有史以来最大的动物基因组，基因组中超丰富的TR DNA加剧了这一技术挑战，成为主要的生物学发现之一。该发现揭示了南极磷虾适应南大洋的基因组基础，并为未来的南极研究提供了宝贵的资源。

高等真核生物基因组存在复杂的三维空间结构，在不同尺度下形成染色质环（Chromatin loops）、拓扑关联结构域（TADs）、活性/非活性染色质区室（A/B compartments）和染色体域（Chromosome territories）。这些结构对于基因组稳定性的维持、基因表达的精准调控具有重要作用，从而影响细胞命运决定和表型建立。经典3D基因组结构主要通过染色体构象捕获（3C）及其衍生方法（如4Cs、5C、Hi-C）以及ChIA-PET为代表的多种形式的高通量技术揭示。这些技术可以捕获细胞核内空间相邻的成对DNA序列，但无法捕获细胞群体中基因组内协同的多位点相互作用（multi-way contact）和单分子拓扑结构（single-allele topology）。此外，基因组3D结构在细胞周期、发育和分化过程中动态变化，并与多个基因及调控区间的染色质相互作用相关。为了充分理解基因组的动态折叠机制和功能相关性，获得细胞群体中的染色体单分子拓扑结构至关重要。

近年来，多种方法如ChIA-drop、split-pool recognition of interactions by tag extension （SPRITE）、Tri-C、multi-contact 4C和Pore-C等已被建立，用于研究染色质多位点协同相互作用和群体细胞的染色体单分子拓扑结构的捕获。这些方法中，Pore-C具有技术简单、可以同步捕获全基因组高阶多位点互作信息和DNA甲基化修饰的优点。

2023年3月6日， 中山大学中山眼科中心肖传乐团队与中国科学院昆明动物研究所侯春晖团队在Nature Communications在线发表了题为“High-throughput Pore-C reveals the single-allele topology and cell type-specificity of 3D genome folding”的研究论文， 该研究优化建立了一种高通量的Pore-C方法，显著增加了高阶染色质互作的检测通量，并揭示了三维基因组的单分子拓扑结构多样性和细胞特异性。希望组提供三代测序服务。

文章发表在Nature Communications

在该研究中，研究团队发现Pore-C技术测序通量相对较低，可能是因为与DNA交联的蛋白质没有被完全去除，导致了测序纳米孔芯堵塞。为了解决这个问题， 研究团队优化了酶解条件，测试了多次蛋白酶解和使用混合蛋白酶的策略（图1）， 大幅提高了测序产量（约80%），近乎成倍降低了该技术的使用成本（图2）。此外，研究团队通过整合NGMLR和Minimap2比对算法开发了MapPore-C比对流程，显著改善了比对准确性和数据利用率低的问题。研究团队还通过与Hi-C数据比较验证了HiPore-C能够高度重现基于Hi-C捕获的染色质环、拓扑相关结构域和染色质区室等基因组3D结构。

图1. HiPore-C方法策略图

图2. HiPore-C与Pore-C技术测序通量和成本的比较

接下来，研究团队分析了染色体间高阶互作，发现大多数互作并非发生在端粒和中心粒之间，而是发生在基因组区域，并形成两个转录活性不同的互作枢纽，其中一个枢纽基因密度、增强子密度和活跃状态染色质相关的表观遗传修饰水平都更高。研究团队还发现多个染色体的tRNA基因富集区域之间发生跨染色体的高频相互作用。HiPore-C高阶互作不仅发生在TAD和compartment内部，而且能够跨越多个区室、拓扑相关域和染色质环（图3）；基于直接和间接的DNA片段间相互作用构建的染色质互作图谱与常规Hi-C图谱总体相似，但间接DNA片段互作更倾向跨越多个结构单元。该研究揭示了跨染色质结构域互作存在的广泛性，并且突出了HiPore-C技术在单分子水平解析基因组三维高阶互作的优势和重要性。

图3. 跨越染色质环的高阶互作

研究团队通过分层聚类的方法，讨论了不同类型细胞的拓扑结构中呈现的单分子拓扑结构集群， 这些结构集群是类亚TAD（subTAD-like）结构域形成的基础，往往具有明显的细胞特异性（图4）。这表明单分子拓扑结构多样性是细胞群体TAD结构域划分的基础，对理解基因组空间结构组织和细胞特异的基因表达间的关系具有重要意义。

图4. K562和GM12878细胞TAD结构域的高阶互作聚类分析

此外，研究团队使用HiPore-C数据比较了红系K562和淋巴系GM12878细胞中在β-globin locus的高阶互作（图5）。结果显示，人ε-和γ-珠蛋白基因启动子和多个增强子之间形成了多位点同时互作、细胞特异的增强子-启动子中心，这种相互作用很可能是动态的。

图5. K562和GM12878细胞中β-globin locus HiPore-C高阶互作分析

最后，研究团队分析了HiPore-C同时捕获染色质高阶互作和DNA甲基化状态的能力，发现DNA甲基化信号与染色质环锚点间相互作用强度呈正相关，此外还可以根据DNA甲基化水平准确地区分染色质区室的类型（AvsB）。