可靠消息，国内某测序巨头准备引进Pacbio SMRT测序平台PacBio RSII系统开始进军三代测序市场，按照惯例，其他小巨头也会紧随其后，所以，小编深深觉得，今年国内肯定要刮起一阵不小的三代测序风，三代测序市场的竞争也将变得激烈起来。

从09年PacBio RS首批测试数据公布暴露出15%的原始错误率（主要为InDel错误）后开始遭人诟病到13年PacBio SMRT首次进入中国市场（Nextomics首家推出）而又普遍不被看好再到如今被国内主要NGS测序公司争相追捧，在小编看来，这算得上是PacBio SMRT君的一次华丽逆袭。

这期，小编将为大家盘点那些让PacBio SMRT君华丽逆袭的那些算法。

显然，直接使用原始错误率为15%且大多数为InDel错误的Reads进行基因组拼装是不可行的，因为大多数基因组组装软件所能忍受的Reads上限错误率<~5%-10%。因此对PacBio RS平台所产生的Reads（错误随机分布）进行比对 & 校正成为了此类数据应用于基因组组装的第一步。

然而大多数比对软件主要是针对高准确率短读长的NGS测序数据设计，比如 SOAP、Bowite、BWA、Maq、SHRIMP、ELAND等，无法对这种读长为数kb、原始错误率15%的三代数据进行比对，虽然在BWA基础上修改得到的可容忍较高错误率且能够进行长读长数据进行比对的BWA-SW却有着比对率不高的缺点。

以下两款专门针对PacBio数据的新型比对软件的出现改变了PacbioSMRT君的这一窘境，也开启了PacBio君的逆袭之路。

NO.1 BLASR （主要针对微生物基因组）

BLASR是基于经典动态规划思想设计的局部比对软件，使用了BWT（Burrows-wheeler Transform）格式的索引结构进行匹配区域快速定位，对于候选匹配区域与最终匹配区域的确定使用了运算速度更快的稀疏动态规划算法（Sparse Dynamic Programing）。

加利福尼亚大学的软件开发人员首先使用产生于大肠杆菌E.coli OH104：H4基因组的48X的PacBio数据（10.7% insertion、4.3% deletion、0.9% substitution）对BLASR的mapping 率、mapping速度进行了评估，结果显示，BLASR mapping率为90%，高于BWA-SW的50%，运行时间为20min 54 S ，小于BWA-SW的434 min 5S。

为了评估该软件的mapping准确率，软件开发人员使用了大肠杆菌基因组的Pacbio 模拟数据对基因组进行mapping，结果显示90%以上的reads mapping 准确度在99.99%以上。见图8^[1]。

        BLASR凭借其优秀的mapping品质与多款Consensus算法软件（AMOS、Quiver、PBDAG-Con等）一起构成了多款后来出现的针对Pacbio数据的基因组组装软件的核心校正算法，这些软件包括二三代混合组装软件PBcR-BLASR、AHA，纯三代组装软件HGAP。

其中纯三代组装软件HGAP（Hierarchical Genome-Assembly Process）是一款基于分级组装思想的基因组组装软件。其大致流程为：

1）挑选较长的reads作为seed reads（>6kb）

2）使用BLASR将较短的的reads mapping 的seed reads上，使用PBDAG -Con一致性算法对reads进行校正并进行预组装

3）使用CA算法对预组装得到的准确率较高的长Reads进行组装

4）将原始reads mapping回组装好的基因组，使用新型一致性算法Quiv er对所得基因组进行进一步校正，最终得到准确率大于99.9999%（QV60） 的高质量的微生物基因组图谱。大致流程见图1。

        Stephen Turner等人分别使用了100X、90X、100X的大肠杆菌、栖热菌、肝素黄杆菌PacBio数据对HGAP的组装效果进行了评估，组装结果中Contig数分别为2、3、1^[1]。

随着Pacbio SMRT的读取长度、运行通量的增加，之前出现的二三代混合组装软件相较于纯三代组装软件HGAP，无论是在测序成本还是组装指标均没有优势，因此，这种二三代混合组装的策略在微生物基因组组装中慢慢被淘汰，对于之前提到的那些二三代混合组装小编就不做过多赘述^[3][4][5]。

NO.2 MinHash（针对大型动植物基因组）

MinHash也是一款基于经典的动态规划思想设计局部序列比对软件，与BLASR不同的是，它采用了最小哈希算法（MinHash）实现了匹配区域的快速定位，该过程如图1所示。

        大致流程为：1）reads Kmer化， 2）将Kmer通过 Hash方程转化为整数格式的fingerprints，3）挑选各自fingerprint最小的Kmer组成用于比对的Kmer集合Sketch 4）使用Jaccard相似度计算Kmer相似度 5）若相似度超过阈值，则返回基因组区域使用动态规划算法详细比对 6）找出匹配区域。

包括Pacbio 的Chen-Shan Chin在内的软件开发人员使用拟南芥、果蝇、人类的PacBio测序数据评估了MinHash算法在大型基因组测序数据比对过程中的性能。结果显示Mapping率在80%左右，准确率均在90%以上，而运行时间仅为15-21 CPU h ，而另一款主要应用于微生物基因组数据比对的BLASR的在大型基因组测序数据比对时运行时间高达上百 CPU h [6]。

之后软件开发人员将MinHash结合新型Consensus软件FalconSense，再整合到OLC组装算法软件Celera Assembler（CA）中得到了大型基因组纯三代组装算法PBcR-MinHash。软件开发人员分别使用了121X、144X、54X的果蝇、拟南芥、人类葡萄胎的Pacbio数据对PBcR-MinHash的组装性能进行了评估，三个物种的ContigN50分别达到了11Mb、20Mb、4Mb。

至此，PacBio SMRT君通过内在的修为弥补了表面缺陷，完成了自己的逆袭之路。

未来组生物（Nextomics Biosciences）基于HGAP已经推出了多款微生物基因组完成图产品，在动植物基因组方面也成功召开了基于三代测序技术的杜仲基因组新闻发布会，感兴趣的小伙伴可以电话或邮箱联系我们。

Paper：

[1] Mark J Chaisson et al. Mapping single molecule sequencing readsusing basic local alignment with successive refinement (BLASR): application andtheory. BMC Bioinformation . 2012

[2] Stephen W Turner et al. Nonhybrid, finished microbial genomeassemblies from long-read SMRT sequencing data. Nature Mehods. 2013

[3] Sergey Koren et al. Hybrid error correction an de novo assembly ofsingle molecule sequencing reads. NatBiotechnol . 2012

[4] Ali Bashir et al. A Hybrid Approach for the Automated Finishing ofBacterial Genomes. Nat Biotechnol .2012

[5] Filipe J Ribeiro et al. Finished bacterial genomes from shotgunsequence data. Genome Research. 2012

[6] Konstantin Berlin et al. Assembling large genomes with singlemolecule sequencing and locality sensitive hasing. Bio Rxiv. 2014

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上期和大家分享了几个三代测序技术在基因组组装中的应用案例，无论是在大型的基因组组装项目亚洲人基因组计划、还是在复杂致病菌基因组(痢疾杆菌、幽门螺杆菌等)测序项目中，三代测序技术 PacBio SMRT 均有着不俗的表现。

这期，小编将结合几篇文献为大家盘点那些使PacBio SMRT迅速崛起的特殊能力。

NO.1 单分子测序

能力描述：

首先要提到的是PacBio SMRT测序平台PacBio RSII的单分子测序能力，这在其他的两个三代测序平台 HeliScope & MinION 也有所体现，这也成了三代测序区分于二代测序的一个标志性特征。

HeliScope 是 Helicos 公司于2008年推出的全球第一台三代测序平台，但由于读长(35bp)、售价等原因在推出后的几年内便惨淡退出测序市场，Helicos公司也于2012年申请了破产保护。 Oxford Nanopore 公司的便携式纳米孔测序 ( Nanopore Sequencing ) 仪MinION目前还处于早期的客户测试阶段，首批测试数据的平均读长已达到了5.4kb，还是有较好的市场潜力。

单分子测序过程通常无须PCR(二代测序中为了将目的荧光信号从背景荧光中区分出来，测序前需要对单条模板链PCR成簇，以放大检测信号)过程，避免了二代测序常遇到的GC偏好性 ( GC bias ) 问题，因此 PacBio RSII 所产生的数据具有极低的GC偏好性，这种数据对于组装高GC基因组或者基因组中高GC区域是非常有利的。

另外, PacBio RSII 单分子测序的特点也使该平台在碱基读取 ( base calling ) 过程中不会出现二代测序平台常遇到的移相(dephasing)问题，所产生的数据更加准确，目前 PacBio RSII 所产生的数据一致性准确率 ( consensus accuracy ) 可达99.99%，如果使用新型一致性算法Quiver，一致性准确率可进一步提高至99.9999%。

相关案例：

1)PacBio SMRT组装高GC基因组相关案例：

Advantages of Single-Molecule Real-Time Sequencing in High-GC Content Genomes

韩国极地研究所研究团队使用 PacBio RS ( Pacibo RSII 早期型号)平台对一株分离与南极乔治王子岛的 Streptomyces 菌株进行了测序，该菌株基因组 GC 含量高达 71%，之前使用 200X 的 Hiseq 2000 数据进行过组装，仍没有获得完整的基因组，组装产生了185 个 contigs ， 随后使用 Sanger 法也仍然无法有效填补。随后研究人员使用仅15 X 的 PacBio SMRT 数据 ( CCS reads + long reads ) 就得到了26个 contig 的组装结果，与二代组装结果比较，发现，二代组装结果中大多数难以填补的Gap多为一些高 GC 区域。

2)PacBio SMRT组装基因组中高GC区域相关案例：

Resolving the complexity of the human genome using single-molecule sequencing

同样地，华盛顿大学的研究团队使用 PacBioRSII 平台对一个人类葡萄胎基因组 （ CHM1 ) 进行了测序，将测序数据 mapping 回人类参考基因组 GRCh37 上，在 GRCh37 GAP区域进行了局部组装 ( local assembly ) ，该研究填补和缩小了人类参考基因组 GRCh37 上接近100个 Gap，这些 GAP 大部分处于高 GC 和重复区域，其中包括一些重要基因表达调控元件。

能力小结：

上述两个案例再次证明了，PacBio RSII平台所产生的极低GC偏好性的数据在高GC基因组或高GC区域的组装中确实有着显著的优势。

对PacBio RSII实现单分子测序的技术原理感兴趣的小伙伴可阅读Stephen Turner ( PacBio 公司创始人 ) 等人在2003年发表在 Science 上一篇关于 ZMWs 的经典文献：

1. W. Turner, et al. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentrations. Science. 2003

NO.2 超长读长(super long-read)

能力描述：

吸取了Helicos公司在三代测序平台开发上的失败经验，PacBio公司在单分子测序的基础上又进一步开发了一套使其三代测序平台 PacBio RSII 更加完美的长读取技术，主要是利用了一种将荧光染料标记于磷酸链末端的dNTP作为边合成边测序(Sequencing by synthesis ) 时的反应底物，聚合反应时，荧光基团可随着焦磷酸基团被DNA聚合酶自然切除，无需其他化学试剂洗脱，最大限度保护了DNA聚合酶活性。

基于该技术，PacBio RSII使用最新的P6C4试剂使测序平均读长由原来的P5C3的8.5 kb 又进一步提高到了10kb-15kb，而早在2005年就诞生的第二代测序技术的读长水平目前还徘徊在数百bp。

PacBio RSII 目前的平均读长(10-15kb)超过了大部分细菌基因组中最大重复区域长度 & 一些小基因组大小(部分病毒基因组、动物线粒体基因组、大部分质粒) & 普通转录本长度。因此，无论是在对于基因组的组装，还是对于转录组的Isoform识别，PacBio SMRT均有着其他测序技术无法比拟的优势。

相关案例：

1)PacBio SMRT在高重复高杂合基因组组装中的应用案例：

杜仲基因组是一种高重复高杂合的基因组，杂合率>1%，重复序列在66%以上，为了解决这类复杂基因组的组装，未来组生物使用了10X PacBio SMRT 长度数据，通过新开发的组装流程，结合第二代测序数据，使得Scaffold N50达到932kb(第二代测序组装对于解决复杂基因组组装存在一定的瓶颈，一般会导致Scaffold N50 小于300kb)，这一成果也在去年的《杜仲全基因组测序重要研究成果》北京新闻发布会上进行了展示。

能力小结：

除过基因组组装外，Pacbio SMRT 也被应用于转录组测序中，由于超长的读长能够使其直接读取完整转录本，无需拼装，该技术已被应用于可变剪辑、基因融合、lncRNA 等转录组分析，从2013年至今，已有数十篇该类文献发表，小编挑了一些比较有代表性的供大家参考。

[1]Sharon, D. et al. A single-molecule long-read survey of the human transcriptome . Nature Biotechnology. 2013.

[2] Tilnger, H. et al. Defining a personal ,allele-specific,and single molecule long-read transcriptome. PNAS. 2014.

[3] Zhang, W. et al. PacBio sequencing of gene families — A case study with wheat gluten genes . Gene . 2014.

NO.3 碱基合成动力学信息记录

能力描述：

PacBio SMRT采用新型的核苷酸荧光标记技术，实现了边合成边测序(Sequencing by Synthesis)过程聚合反应的连续进行，PacBio的工程师们使用了一台内置有帧率100HZ的电子倍增CCD(EMCCD)相机的共聚焦荧光显微系统实现了对这一过程的实时(Real-time)监测，因此Pacbio RSII 在记录碱基先后顺序的同时也记录下了碱基渗入模板链的速度(碱基合成的动力学信息)，DNA聚合酶在甲基化修饰或者磷硫修饰位点处反应速度有所降低，在合成动力学信息中，则表现为荧光脉冲信号的延迟(increased interpluse duration，IPD )。基于此原理，PacBio RSII在DNA序列测定的同时获得了其甲基化修饰位点信息。

相关案例：

1)PacBio SMRT在甲基化修饰位点检测中的应用：

Genome-wide mapping of methylated adenine residues in pathogenic Escherichia coli using single-molecule real-time sequencing

布莱根妇女医院(Brigham and Women’s Hospital,BWH)等机构的研究人员利用了PacBio SMRT测序技术对溶血性尿毒病原菌E.coli O104：H4基因组中的化学修饰位点进行了测定(190X测序数据)，分析了基因组中的5mC与6mA修饰，由此绘制了全球首张致病菌全基因组水平甲基化修饰位点图谱。

2)PacBio SMRT在磷硫修饰位点检测中的应用：

Genomic mapping of phosphorothioates reveals partial modification of short consensus sequences

来自上海交通大学的研究团队利用 Pacbio RSII 对大肠杆菌基因组中的磷硫酰化修饰(PT)位点进行了测定，绘制了全球首张细菌全基因组水平磷硫酰化修饰(PT)位点图谱。

能力小结：

DNA化学修饰位点检测是表观遗传学研究的重要内容，基于PacBio SMRT 的 DNA化学修饰位点检测技术操作更加简单(无需重亚硫酸盐处理)、表观修饰检测类型更加多样、准确性更高等优点。

小编还意犹未尽，但限于篇幅，今天只能到这里了，下期接着聊。下期将为大家聊那些为三代而生的算法们，敬请关注!

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