测序技术新时代

自454开启了第二代高通量测序的一扇新世界大门，测序技术飞速发展，高通测序技术呈现出百花齐放的姿态，最后Illumina赢得了第二代高通测序最后的战役，但风云变幻，出现了新的改变者——第三代测序技术PacBio SMRT和Oxford Nanopore Technologies。

ONT的概念从上个世纪80年代就提出来，但从理论到商业化应用，走了二十多年，2014年，ONT对外提供MinION试用项目计划（MAP），随后几年不断对早期版本仪器的高错误率和低通量问题进行改善，从2016年开始，Nanopore平台通量得到较大提升，错误率也显著降低，在基因组中的应用已从小基因组逐渐延伸到复杂动植物基因组中的应用，而更高通量平台GridION X5 和PromethION的发布将对Nanopore在复杂物种中的应用更为简单和便捷。

1 纳米孔测序技术原理

在牛津纳米孔测序技术中，将纳米孔蛋白（Nanopore）插入由合成聚合物形成的膜（Membrane）中，该膜具有非常高的电阻，通过对膜上施加电势，在纳米孔产生离子电流。当DNA分子通过纳米孔时，会形成特征性离子电流变化信号，该纳米反应信号可用于确定DNA分子上碱基的序列。其中，DNA分子上接的马达蛋白（Motor Protein）会附着在纳米孔蛋白上，控制DNA分子以一定速度通过纳米孔，一个纳米孔处理完一个序列后，可重新开始另外一条新的序列。

小提示

1. Membrane：该膜具有非常高的电阻，通过对膜上施加电势，在纳米孔产生离子电流。
2. Motor Protein：为解旋酶，在构建文库时，马达蛋白会随引导接头一同加在DNA分子上，在测序过程中，马达蛋白会对双链DNA解压和解链，使得单链DNA以一定速度经过纳米孔。

2 Nanopore平台升级

Nanopore平台自2014年进行MinION MAP项目开始，不断从flowcell、纳米孔、测序试剂和信号捕获及碱基识别软件等方面进行升级改进，其中，测序纳米孔最开始为R6，后面不断升级，出现了R7，R8，R9版本，到现在已经升级为R9.4，随之而来的是准确率和通量的提升。

Figure 2 Nanopore平台改进后的数据产量和准确率比较

除从MinION的硬件和软件全方位升级外，ONT还发布了MinION延展性平台GridION X5和 PromethION，在延续了MinION的核心测序技术及操作简单和文库制备快外，弥补了MinION测序仪通量低，及不适用于大批量样本或大基因组测序的不足（Table 1）。

Table 1 Nanopore平台参数对比

3 建库方式

1. 在1D 建库中，仅有引导接头（Leading Adaptor），在测序过程中，首先，马达蛋白对双链DNA解压和解链，引导接头通过纳米孔，随后模板链通过。
2. 在2D建库中，既有引导接头，还有连接双链DNA分子的发夹接头（Hairpin Adaptor），在测序过程中，首先，马达蛋白对双链DNA解压和解链，引导接头通过纳米孔，随后模板链通过，然后发卡接头和互补链通过。
3. 在1D2建库中，DNA双链分别通过纳米孔，但并未如2D测序中通过发卡接头连接。当模板链完成测序后，之后纳米孔会捕获互补链的马达蛋白进行互补链测序。

Figure 3 Nanopore测序中3种建库模式

1D测序优势在于文库构建更便捷，可低至10min，可得到更长read，相对1D测序，2D测序中模板链和互补链序列可以得到高质量的一致性序列。

4 下机数据

Nanopore平台下机数据格式为FAST5格式，每条read都有各自的FAST5文件，除碱基信息，还含有信号数据及其他宏数据，所以read文件大小远大于read碱基大小，FAST5文件需要转化为FASTA和FASTQ格式再进行后续分析。在1D reads中通过判断是否通过平均质量值来确定下机read为“Pass”或者“fail”，在2D reads中，还需要兼顾模板链和互补链的质量。

Figure 4 每条read的FAST5文件示意

5 在基因组组装中应用

ONT和PacBio技术间的读长和错误率有相似性，因此，在ONT基因组组装中会采用PacBio的一些方法，如overlap, layout, consensus等组装原理，这些原理都来源于早期Sanger数据组装应用，目前Nanopore数据分析可适用的分析工具参考下面表格建议（Table 2）。

目前Nanopore数据组装中应用最为广泛的是Canu，有数据校正步骤，不过最后需要用Nanopolish进行polish；Miniasm是PacBio和Nanopore数据组装的一款工具，典型特征就是快，比如线虫基因组组装在16核运算条件下，仅需9分钟完成组装，因为追求速度，也牺牲了组装准确性。

Table 2 常用适用于Nanopore数据的分析工具

随着Nanopore平台不断升级，通量和准确率得到极大提升，不断有研究者开始通过Nanopore数据进行更大基因组组装，如100Mb线虫基因组，再到G级别的番茄基因组，未来Nanopore技术平台在复杂基因组中应用潜力无限。

参考来源

1.Leggett R M, Clark M D. A world of opportunities with nanopore sequencing[J]. Journal of Experimental Botany, 2017: erx289.

2.de Lannoy C V, de Ridder D, Risse J. A Sequencer Coming Of Age: De Novo Genome Assembly Using MinION Reads[J]. bioRxiv, 2017: 142711.

3.https://nanoporetech.com/

导读

近日，中山大学研究团队开发的适用于长读长数据分析的新工具MECAT于Nature Method在线发布。与目前PacBio SMRT测序组装中常用工具相比，MECAT运算性能更优，运算结果结果相当或有提升，其中值得指出的是，运用MECAT分析工具，分析人员在个人计算机上即可对大基因组进行参考序列比对或基因组de novo组装。

来自Pacific Bioscience和Oxford Nanopore三代单分子测序技术的超长读长自面世就不断给基因组学领域的研究者惊喜，解决了很多基因组组学难题，助力多篇文章登上高分杂志。不过就像“你看见学霸轻松得高分，却没有看到学霸半夜挑灯夜战”一样，三代数据常用组装软件，如Falcon 、Canu和HGAP等都是基于两两比对确定overlap和纠错，这个过程非常耗时，基本上会花去整个组装过程中的大部分时间，对计算机资源消耗异常，对分析人员而言，真的会“挑灯夜战”。

未来组参与的“华夏一号”亚洲人基因组项目，当时国内外均缺乏纯三代测序数据进行大基因（>1Gb）组装的现成经验，已有生物信息分析学软件也不完善，而分析过程中面临着海量数据产出和大型基因组组装分析系列挑战，于是未来组同项目研究人员对FALCON进行改写和优化，顺利完成了这个项目。

针对以上问题，很多专注于长读长数据分析的团队，都在进行三代测序分析软件的优化工作，或开发更为高效的分析方法。中山大学研究团队开发的新工具MECAT（https://github.com/xiaochuanle/MECAT），可提高三代测序数据序列比对，校正和组装的运算速度，降低计算资源的消耗。

MECAT中算法原理

MECAT比对中采用全局种子打分算法，将长序列分成多个Blocks，序列间Blocks的k-mer进行比对（Figure 1a），以其中Block2为例，通过DDF（距离差异因子）对k-mer pair间打分（Figure 1b），以分数最高的为K-mer pair种子（Figure 1c），再以K-mer pair种子对其他block打分（Figure 1d），最后确定了2条序列间关系（Figure 1e），最终减少了局部序列比对的候选区域，进而减少比对所耗费时间。比较分析发现，通过DDF可以过滤掉50%-70%的候选区域比对（Figure 1g）。

Figure 1 MECAT算法原理图示

MECAT序列比对评估

总体来说，不论是PacBio数据还是Nanopore数据， MECAT都比其他比对工具快很多（Table 1）。

在5组PacBio数据集（E. coli，Yeast，A. Thaliana，D. melanogaster，Human）序列比对中， MECAT比对速度更快，其中在Human大型基因组数据的比对中，MECAT alignment的比对速度是MHAP-fast的5倍，是DALIGNER的17倍。

在3组Nanopore数据集（E. coli，B. anthracis，Y. pestis）序列比对结果中，由于其错误率高，MECAT运算中降低了比对参数，因此相比PacBio数据，MECAT在Nanopore中数据比对较慢。

Table 1不同比对方法在序列和参考基因组中比对结果

在对MECAT的比对敏感性和准确性评估中，基于3组模拟的PacBio数据集（E.coli，Yeast，Humanchr1）来进行了测试，相对MHAP和DALIGNER，MECAT aligner在敏感性和准确性都较高，且不论是小基因组还是大基因组，在敏感性和准确性上都表现出平衡。

MECAT基因组比对评估

MECAT在基因组比对中速度、敏感性、准确性和覆盖度都优于其他软件。

在4组PacBio数据集（E. coli，Yeast，A. Thaliana，D. melanogaster，Human）基因组比对分析中，MECAT在小基因组对比速度是BLASER的35-65倍，是BWA-mem的19-70倍，在人基因组中，比对速度也有BLASER和BWA-mem的几倍到十几倍（Table 1）。

在3组Nanopore数据集（E. coli，B. anthracis，Y. pestis）基因组对比分析中，MECAT是BLASER的2-5倍，是BWA-mem的4-6倍（Table 1）。

同时，三种比对算法的比对重叠率高达95-99%，这也表明MECAT的高可信度（Figure 2）。

Figure 2 MECAT，BLASER和BWA基因组比对重叠图示

*为Nanopore数据

同样的，MECAT在基因组比对中，不仅速度快，而且也兼顾了高敏感性、准确性及覆盖度（Table2）。

Table 2不同方法在基因组比对中的敏感性和准确性评估对比

MECAT数据纠错评估

MECAT能降低进入局部序列比对的候选序列数量，这也降低了后续校正时间，MECAT的序列校正优于其他常用校正软件。

在对4组PacBio数据集（E. coli，Yeast，A. Thaliana，D. melanogaster，Human）校正分析中，MECAT的速度是FC_Consensus的4–10倍，是FalconSense的5–21倍。

在对3组Nanopore数据集（E. coli，B. anthracis，Y. pestis）校正中，MECAT速度是FC_Consensus 的1.06~7倍，是FalconSense的1.6~11倍。

Table 3不同方法在长读长read校正中的速度和准确性对比

从以上测试评估中可以看到，与其他三代分析工具相比，MECAT在序列比对、校正方面做到了速度快，敏感性和准确性高，在组装上如何？于是研究者运用MECAT对CHM1基因组重构，结果发现也比PBcR-MHAP-fast（24.9x）, PBcR-MHAP-sensitive（56.3×），Canu(5.1×) 快上几十倍，后面又利用102×PacBio数据（华夏一号-HX1）在单个32核计算机上完成了中国人基因组的组装工作。

测序技术的发展不仅局限于测序平台的不断创新，其上下游工作，如DNA/RNA提取、文库构建、数据分析等也同样重要，也需要如中山大学这样的研究团队一同努力，兼顾行业上下游工作的研发，从整体上推动行业发展和应用。

参考文献

XiaoC L, Chen Y, Xie S Q, et al. MECAT: an ultra-fast mapping, error correction andde novo assembly tool for single-molecule sequencing reads[J]. Nature Method, 2017. doi:10.1038/nmeth.4432

未来组参与的异源四倍体棉花全长转录组项目文章于9月11号见刊New Phytologist，华中农业大学研究团队基于PacBio测序，并整合Iso-Seq流程开发适用于区分2套亚基因组转录本的分析方法，克服了短读长测序在解析多倍体isoforms的技术瓶颈，揭示了纤维特异性的可变剪接事件，2套亚基因组中部分同源基因的isoforms差异，并在isoforms水平上揭示了miRNA对可变剪接事件的调控，为研究多倍体物种可变剪接提供了新的研究角度。本次研究采用PacBio SMRT测序技术，对异源四倍体棉花进行全长转录组测序分析，直接得到更为完善的全长isoforms，完善棉花转录组注释，解析了异源四倍体棉花组织和2套亚基因中AS复杂性，并整合多组学数据，揭示AS的调控机制。
已有大量研究基于高通量测序技术揭示了真核生物转录组中的可变剪接（AS）的广泛性和复杂性，以及在植物发育阶段或应激反应中对AS进行全基因组范围内研究。基于短读长的RNA-seq在准确拼接重构全长isoforms时充满挑战，无法避免假阳性AS事件，尤其是在面对多倍体物种时，情况更加复杂。

研究方法

1.采集异源四倍体棉花Gossypium barbadense L. cv 3-79的根、下胚轴、叶、花瓣、花粉和花柱6个组织样本，提取RNA，等量混合，反转录为全长cDNA，构建1-2kb，2-3kb，3-6kb文库，上机PacBio RSII，P6C4，共测15Cells。

2. 采集Gossypium barbadenseL. cv 3-79 6个发育时期（开花后0天即0 DPA、7 DPA、10 DPA、12DPA、20 DPA和30 DPA）的棉花纤维样本，提取RNA，等量混合，反转录为全长cDNA，构建1-2kb，2-3kb，3-6kb文库，上机PacBio RSII，P6C4，共测15Cells。

研究结果

1 全长转录组分析流程优化

在异源四倍体棉花全长转录组分析中，针对四倍体物种开发了整合性Iso-Seq数据分析流程(https://github.com/Nextomics/pipeline-for-isoseq)，其中包含了数据质控、转录本分类、isoforms聚类及转录组后续分析（Figure 1），使用Samtools phase对来源于2套序列相似性极高的亚基因组的转录本进行区分（Figure 2）。

Figure 1 异源四倍体棉花的Iso-Seq数据分析流程

Figure 2 At和Dt 亚基因组上的转录本比对

2 Iso-Seq解析了多倍体棉花广泛的可变剪接、可变多聚腺苷酸、融合基因、新LncRNA等形式

（1）下机数据分析，共得到全长转录本1,096,932（ca. 43.2%）（Figure 3A），经mapping、phasing、clustering、consensus后总共得到44,968个基因的176,849个isoforms，其中全长isoforms平均2,175bp，比参考序列转录本平均1,462bp的长度长（Figure 3C），并且Iso-Seq可得到更多的多外显子isoforms（Figure 3D）。

（2）通过与参考序列比对，更新了18,008个基因，确定了222个融合基因，在新的转录本中确定了2,447个LncRNA，与LncRNA_V1比较，确定了365个新的LncRNA（Figure 3E）。在Iso-Seq中检测的44,968个基因中，基因上平均polyA位点数目为2.82（Figure 3F），同时分析了polyA位点侧翼核苷酸序列，其表现出核苷酸偏向性特征，在3’UTR的polyA剪切点的上游富含U碱基，在下游富含A碱基（Figure 3G），同时在polyA剪切点上游确定了2个保守的motifs（AAUAAA和UGUA）。

Figure 3 经Iso-Seq得到的棉花转录组图示

1. 转录本分类 B.全长isoforms在文库中mapping汇总 C. 参考数据和Iso-Seq数据中转录本长度分布 D. 在参考数据和Iso-Seq数据中isoforms中外显子数目 E. Iso-Seq数据及中检测的全长LncRNA与LncRNA_v1的Venn图 F. 基因上polyA位点数目分布 G. polyA剪切点（-50 ~ +50）的核苷酸相对频率

（3）经Iso-Seq检测133,229个AS事件，发现63.8%基因的AS事件为内含子保留（IR）（Figure 4A），平均每个基因对应3.93个isoforms，大概是参考注释中的2.9倍（Figure 4B），另外，随机挑选了5个基因，根据其预测转录本设计引物，经RT-PCR来验证Iso-Seq中AS事件的检测，发现扩增片段与预测片段相符，同时，也发现了isoforms的表达量具组织特异性（Figure 4C）。

Figure 4 AS事件特征图示及全长isoforms的RT-PCR验证

A. AS事件分类及相对应的基因和AS事件数目

B. 参考数据和Iso-Seq数据中基因对应isoforms数据

C. 5个基因的AS事件的RT-PCR验证

3 组织特异性isoforms的结构和表达量差异分析

结合来自纤维样本和非纤维样本的Iso-Seq数据对比，检测到来自15,871个基因的66,652个两者共有AS事件（Figure 5A），经RNA-Seq数据对isoforms的表达量进行分析，发现组织特异性isoforms与isoforms组织特异性表达表现出一致（Figure 5B），挑选PB.1316进行验证，PB.1316可以转录为T1和T2两个isoforms，实验发现T1有些在非纤维组织中表达，如根和叶，在纤维发育过程中，T1表达量不断降低，而T2出现高表达（Figure 5C）。

Figure 5组织特异性AS事件和isoforms图示

A.组织特异性AS事件和相应基因的Venn图

B. 组织特异性AS事件类型图示

C. 最大组织特异性数值分布

D.PB.1316的2个isoforms（T1和T2）的转录模式 E. 对7个样本中PB.1316进行RT-PCR验证

4亚基因组的同源基因表现出isoforms结构差异

（1）结合已研究的16,077同源基因对和Iso-Seq数据，得到6,202对同源基因，可以分为3大类，其中group I中1,605对基因中At基因组isoforms数目呈收缩，group II中3,017对基因两者没有差异，而group III中1,580对基因中Dt基因组isoforms数目呈收缩，并对三个group进行GO分析（Figure 6A）。

（2）挑选来自不同group的三个基因对，group I的PAP10在At亚基因组中只转录1个isoforms，而在Dt亚基因组中转录6个不同isoforms；group II的ERD3在At和Dt亚基因组中都转录6个不同isoforms；group III的CPN60A在At基因组中可转录16个不同isoforms，而在Dt基因组中仅转录1个isoforms（Figure 6C-D）。

Figure 6  At和Dt亚基因组中同源基因isoforms数目

A. At和Dt亚基因组中同源基因isoforms log2比值及GO注释

B. At和Dt亚基因组同源基因PAP10的isoforms

C. At和Dt亚基因组同源基因ERD3的isoforms

D. At和Dt亚基因组同源基因CPN60A的isoforms

5 isforms多层面的调控——miRNAs和表观修饰

（1）对6个组织进行小RNA测序并整合已有的研究中测序的miRNAs，发现miRNAs结合AS在isoforms水平调控基因表达量。如PB.42410有5个isoforms，其中2个是miR399的靶序列； PB.18525可转录2个isoforms，其中1个isoform是miR397的靶序列，因为ES等事件PB.42410或PB.18525转录的其他isoforms而缺失了miRNA靶位点；PB.44799和PB.44311因为IR事件而获得miR7484和miR8634的靶位点；PB.27256和PB.2778转录的isoforms在 3’UTR和5’UTR分别获得miR396和miR827的靶位点（Figure 7A-F）。

Figure 7 miRNAs对全长isoforms靶向确定

（2）结合已有棉花纤维发育阶段的表观修饰分析数据与此次研究中的纤维样本的AS数据，在分析不同AS中核小体占位密度和DNA甲基化水平中，发现其可能都在定义外显子中起重要作用（Figure 8A和B）；基于全长isoforms的UTRs注释，将其与CDSs的DNA甲基化水平对比，发现CG，CHG，CHH甲基化水平差异较小（Figure 8C,D,E,F,G和H），另外，经RdDM通路参与DNA甲基化的24-ntsiRNA在UTRs区域明显增加，可能与3’UTRs区域的CHG和CHH甲基化水平增加相关，这些都给AS和基因表达的甲基化调控提供了新思路。

Figure 8 isoforms中核小体占位和DNA甲基化分析图示

本次研究中经Iso-Seq测序，拓展了多倍体棉花的转录组研究，并从组织特异性和亚基因组角度确定了其中可变剪接的复杂性，结合多组学数据，分析了可变剪接事件的调控机制，而这些研究的基础关键在于需先获得全长isoforms。同时，文章也给予我们在转录组研究一些启发，在表型差异的转录组研究中，不仅需关注与其相关基因的表达量相关，也要考虑到可变剪接中的不同isoforms作用。

参考文献：

Wang,M., Wang, P., Liang, F., Ye, Z., Li, J., Shen, C., Pei, L., Wang, F., Hu, J.,Tu, L., Lindsey, K., He, D. and Zhang, X. (2017),A global survey ofalternative splicing in allopolyploid cotton: landscape, complexity andregulation. New Phytol. doi:10.1111/nph.14762

近日，由湖南农业大学研究团队完成，未来组参与的冬虫夏草线粒体基因组项目文章见刊Frontiers in Microbiology。研究经PacBio SMRT测序技术，解析了冬虫夏草线粒体基因组完成图，并构建肉座菌目真菌系统进化分析，为冬虫夏草的分类地位提供了遗传学证据，同时，对线粒体基因组范围的DNA甲基化修饰进行分析，为目前首篇研究真菌线粒体基因组表观修饰的论文报道。

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是冬虫夏草菌感染蝠蛾幼虫而形成的冬虫夏草菌子实体与僵虫菌核（幼虫尸体）构成的复合体，是中国传统名贵中药材，主要产于中国西藏高原等高寒地带和雪山草原。冬虫夏草线粒体基因组完成图的获得可对冬虫夏草的进化和系统分类进行深入分析，同时，在PacBio测序中，带有甲基化修饰的DNA碱基会出现荧光脉冲信号的延迟，可直接被识别检测到，因此从测序原始数据中直接获得冬虫夏草线粒体基因组的甲基化信息，也为肉座菌目真菌线粒体基因组的表观修饰的进一步研究提供参考。

研究方法

采集冬虫夏草子实体进行DNA提取；质检合格后，构建20kb文库，上机PacBio RS II测序，P6C4，8个SMRT cell；将过滤后数据与已公布的201个真菌线粒体基因组比对，提取属于线粒体的序列，经HGAP组装；后进行线粒体基因组注释、甲基化和进化分析。

研究结果

1. 经组装，得到成环的冬虫夏草线粒体基因组57,539bp，含有14 个保守蛋白编码基因（PCGs）， 1个rps3， 27个 tRNAs和 2个 rRNA，其中AT含量占69.8%。另外，冬虫夏草线粒体基因组中内含子54个，与肉座菌目其他真菌相比数量最多，分析还确定了73个ORFs（Figure 1 和Table 1）。

Figure 1冬虫夏草线粒体基因组圈图

Table 1 肉座菌目真菌线粒体基因组特征对比

2. 基于14个与OXPHOS系统相关的保守PCGs做ML系统进化树分析，分类结果确定了冬虫夏草在虫草科中的分类地位，再次更正了之前经冬虫夏草形态学分类到Cordycepssp. 的错误（Figure 2）。

Figure 2基于冬虫夏草线粒体基因组中14个PCGs ML系统进化树

3. 基于19个肉座菌目真菌rps3基因构建的进化关系，发现与上述基于PCGs的系统进化关系有差别，在对肉座菌目中rps3基因的选择压力分析中，加入了外群P. nordicum，发现肉座菌目真菌受正选择压力（Figure 3），rps3的36个序列位点受正选择压力（dN/dS >1），其中16个序列位点具统计显著性（P ≥0.95）(Table 2)。

Figure 3基于肉座菌目真菌rps3基因构建系统进化树

Table 2肉座菌目真菌rps3基因对数似然函数值及参数评估

4. 在冬虫夏草线粒体基因组中，确定了1604个修饰位点（正向链783个，反向链821个），平均modQV scor（特定修饰信息的一致性）为24.68，平均覆盖度在96×左右（Figure 4）。在其中确定了28个4mC（0.13%）和10个6mA（0.017%）的修饰位点，大部分6mA和4mC分布在基因间区或内含子区，仅有3个DNA甲基化分布在编码区nad2，nad4L，nad5（Table 3），研究推断其甲基化信息可能与冬虫夏草在寒冷及低PO2的高海拔环境生长适应性相关。

Figure 4 冬虫夏草线粒体基因组中DNA修饰

Table 3 冬虫夏草线粒体基因组的6mA和4mC信息 

PacBio SMRT测序技术的长读长有效解决了冬虫夏草的线粒体基因组中高AT区域或高重复区域难题，得到线粒体基因组完成图，准确定义了基因组特征和进化地位，这一优势也已延伸到科研项目中解决大基因组的复杂区域难题；同时，PacBio测序原始数据可直接用来检测基因组中DNA修饰信息，可让研究者从表观修饰信息角度挖掘与环境适应性相关的分子机制。

参考文献

Kang X, Hu L, Shen P, et al. SMRT sequencing revealed mitogenome characteristics and mitogenome-wide DNA modification pattern inOphiocordyceps sinensis[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 1422.

普通小麦基因组高达17Gb，为异源六倍体AABBDD类型，且含有80%的重复序列，使得小麦基因组解密历程艰辛。研究学者面对困难，勇敢直前，一步一步地绘出不同小麦基因组图谱。近期，研究者再次添砖加瓦，于Science发表野生二粒小麦基因组研究成果。

解析野生二粒小麦基因组AABB

现代的六倍体小麦AABBDD Triticum aestivum是经异源四倍体野生二粒小麦Triticum turgidum（WEW）驯化为有脱粒特性的现代二粒小麦（DEW）后，与二倍体DD Aegilops tauschii杂交形成。野生二粒小麦基因组的解析将可以从另外一个角度了解小麦的进化。

基因组组装

WEW基因组在测序策略上，构建了不同大小插入片段文库，经176x 深度的Illumina测序组装，组装10.1G基因组，Contig N50 57.37k，经遗传图谱和Hi-C进一步验证组装，最后得到Scaffold N50=6.96M，将基因组锚定到染色体上，然而，其中不确定的Scaffolds有0.4Gb，Scaffolds间gaps有~1.5Gb，经BUSCO评估，基因组组装完整度在98.4%。

注释及进化分析

WEW的2个亚基因组的同源性分析，发现其中72.3%同源基因对，同源基因对的表达模式和表达水平相似。另外少量同源基因对只在一个亚基因组中表达，功能富集分析表明，亚基因组调控的基因表达可能与小麦品种相关。

在WEW基因组注释中，预测了82.2%转座子序列，大多数转座子元件为长末端重复反转录转座子LTR-RTs，不同类型的转座子在2套亚基因组中含量相似。而大部分全长LTR-RTs在150W年前发生扩张。Ty3和未分类的转座子在A与B亚基因组中类似，而Ty1/copia发生在500W年前，这与A和B亚基因组杂交的预计时间相一致。

为了进一步研究不落粒的驯化性状，对Zavitan和Svevo杂交，发现了调控脆性BR表型的基因区域，其中包括WEW染色体3A和3B上的2个位点(15.5Mb，32.5 Mb)，确定了小麦基因(chromosome-3A: TtBtr1-A和 TtBtr2-A；chromosome-3B: TtBtr1-B 和TtBtr2-B)。在栽培种中TtBtr1等位基因在编码区发生突变，而在栽培种和野生种中，TtBtr2未发生编码区突变，推断2个基因中的突变是互补的，获得R栽培表型。

通过外显子测序，驯化和野生二粒小麦显著分离成2个亚群，野生二粒小麦分布以色列、叙利亚、黎巴嫩和土耳其地区，栽培二粒小麦分布印度洋、地中海、东欧和高加索地区，与野生小麦相比，栽培小麦的多样性下降。

小麦基因组解密历程艰辛

面包小麦即普通小麦（Triticum aestivum）是世界上种植面积广泛的农作物，是全球重要的粮食作物。普通小麦基因组不仅规模大（高达17Gb），而且基因组复杂，为异源六倍体AABBDD类型，含有3套亚基因组，亚基因组间相似性高，无法定位基因来自哪套染色体，且含有80%的重复序列，这些都使得小麦基因组解密历程艰辛。

异源六倍体小麦基因组的常规测序策略是通过构建BAC文库，结合鸟枪法测序；在材料选择上，会选择从小麦的二倍体供体开始基因组测序，为下一步深入解析六倍体小麦基因组及驯化、重要农艺性状等研究做参考。

下面组学君盘点了已发表小麦基因组的几个典型。

2012年11月，Nature，Triticum aestivum，AABBDD

利物浦大学、加州大学戴维斯分校等 9所研究机构合作对小麦基因组进行了测序。研究中经454测序平台对普通小麦栽培品种Chinese Spring基因组进行测序组装，并与其二倍体祖先基因组比较，确定了9万多个基因。分析发现普通小麦在多倍化和驯化过程中，基因组中有大量基因家族丢失和基因片段冗余。其中发生扩张的基因家族大部分参与能量采集、代谢和生长等过程，与作物产量相关。进一步，研究确定了小麦基因与特定性状之间的关联，这些都为加速栽培小麦育种提供遗传资源。

2013年3月，Nature，Triticum urartu，AA

中科院遗传与发育生物学研究所领衔完成了小麦A基因组的测序工作。小麦A基因组的祖先物种二倍体野生一粒小麦，即乌拉尔图小麦，经91X的 Illumina HiSeq 2000测序，组装得到Contig N50=3.42 kb，Scaffold N50=63.69 kb，基因组序列注释结果表明，66.88%的基因组为重复元件，同时发现一些重要农艺性状基因和分子标记。

2013年3月，Nature，Aegilops tauschii，DD

中国农业科学院作物科学研究所牵头完成对小麦D基因组测序，经90X不同插入片段的短读长测序，组装的Scaffolds覆盖了83.4%基因组信息，其中65.9%为转座子，经RNA-seq对确定了43,150编码蛋白基因，其中71.1%经遗传图谱锚定到染色体上。基因组组装注释分析，揭示了与抗病性、生物胁迫和籽粒品质相关的基因家族发生扩张。

2014年7月，Science，Triticum aestivum，AABBDD

中国农业科学院作物科学研究所牵头完成对小麦D基因组测序，经90X不同插入片段的短读长测序，组装的Scaffolds覆盖了83.4%基因组信息，其中65.9%为转座子，经RNA-seq对确定了43,150编码蛋白基因，其中71.1%经遗传图谱锚定到染色体上。基因组组装注释分析，揭示了与抗病性、生物胁迫和籽粒品质相关的基因家族发生扩张。

未来展望

依据测序技术不断发展，基因组的解析有了更多选择。在2017年PAG会议中，中国农业科学院作物科学研究所报道了最新的节节麦DD基因组进展，通过结合DeNovoMagicTM2 Nrgene，Illumina X10，PacBio和10xGenomics数据，组装结果不断提升。并通过Cytogenetic技术, CEGMA, BUSCO分析，与BAC序列比对评估组装结果，均表明组装结果有很大提升。

目前PacBioSMRT长读长测序技术是复杂基因组测序组装的利器，组学君认为这一优势将能在异源六倍体小麦基因组及二倍体四倍体小麦基因组的深入解密中发挥优势，填补基因组中gaps，挖掘更多小麦基因组家族中的“暗物质”。等待各位研究学者的持续解密！未来组愿助力各位在小麦及其他作物研究中的工作。

参考文献

1.Avni R, Nave M, Barad O, et al. Wild emmer genome architecture and diversity elucidate wheat evolution and domestication[J]. Science, 2017, 357(6346): 93-97.

2.Brenchley R, Spannagl M, Pfeifer M, et al.Analysis of the bread wheat genome using whole-genome shotgun sequencing[J].Nature, 2012, 491(7426): 705-710.

3.Ling H Q, Zhao S, Liu D, et al. Draft genome ofthe wheat A-genome progenitor Triticumurartu[J]. Nature, 2013, 496(7443): 87-90.

4.Jia J, Zhao S, Kong X, et al. Aegilops tauschii draft genome sequence reveals a gene repertoire for wheat adaptation[J]. Nature, 2013, 496(7443):91-95.

5.International Wheat Genome Sequencing Consortium. A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome[J]. Science,2014, 345(6194): 1251788.

6.Marcussen T, Sandve S R, Heier L, et al. Ancient hybridizations among the ancestral genomes of bread wheat[J]. Science, 2014,345(6194): 1250092.

7.Pfeifer M, Kugler K G, Sandve S R, et al. Genome interplay in the grain transcriptome of hexaploid bread wheat[J]. Science,2014, 345(6194): 1250091.

8.Choulet F, Alberti A, Theil S, et al. Structural and functional partitioning of bread wheat chromosome 3B[J]. Science, 2014,345(6194): 1249721.