本文使用Oxford Nanopore 测序技术对秀丽隐杆线虫的两个品型（野生型；带有两个复杂染色体重排区域的突变型）进行了全基因组测序，完善了秀丽隐杆线虫参考基因组，研究突变型中复杂的重排机制。2017年12月，文章发表于Genome Research。

秀丽隐杆线虫的基因组虽然较小（~100Mb），但是含有大量各种类型的重复序列，其中最普遍的是转座元件，占到基因组的12%。线虫转座子的大小一般在1-3Kb，超出了二代测序和sanger测序的读长范围，如果利用这两个技术对基因组进行测序组装，会导致拼接错误，更不用说准确识别染色体重排、大区段插入、缺失等结构变异了。

为了攻克这些用以往的短读长测序技术无法解决的技术瓶颈，研究人员使用Oxford Nanopore MinION，对秀丽隐杆线虫的两个品型进行了长读长测序并分别de novo组装。

亮点

 1.组装完整度、连续性和准确性高

通过~60×Nanopore数据，组装出野生型秀丽隐杆线虫基因组，仅由48个contig组成，N50达3.99Mb，覆盖了参考基因组>99%的区域。

Fig.1 组装出线虫基因组中的contigs与参考基因组有极高的比对一致性

基于长读长优势，Nanopore与二代测序相比，在重复序列区域具有更好的跨越性，能更准确地识别重复元件，完善了参考基因组中>2MB的序列。

Fig. 2 (A)高测序深度的区域可能与重复序列相关

(B)通过重复区域测序深度与全基因组测序深度的比较，分析重复区域contigs组装的准确性

(C)长的测序reads跨越重复序列，增强了contigs组装连续性

原始测序数据准确度~86%，原始canu组装contig单碱基准确度~98%，经二代数据4Xpolish校正后最终达99.8%。

2.研究突变系中复杂的重排机制

1）II号染色体上xpf-1(e1487)区域重排

该突变由乙醛诱变产生，在xpf-1有复杂的重复和插入引起的重排。

Fig.3左侧纵坐标处为野生型线虫的xpf-1模型，右侧纵坐标为mab-3（~20kb）模型。诱变系的xpf-1重排区域中，复制了mab-3，并将其分2段插入到xpf-1的第二个外显子中（Fig.3中蓝色）。另外，插入片段中较大的那一部分，与xpf-1第二个外显子的一部分侧翼一起，再次发生了复制并形成倒转（Fig.3 中绿色和红色）。

Fig.3诱变系线虫Ⅱ号染色体上重排区域（xpf-1）示意图

以往的研究只能以寡核苷酸阵列、RT-PCR、反向PCR等技术对该诱变系的染色体重排模型进行预测。而在本研究中，借助Oxford Nanopore全基因组测序，组装出的一个单独的contig(contig017)包含了完整的xpf-1(e1487)重排区域，从而进行更准确地诠释。

2）Ⅲ号染色体上ruIs32区域，外源质粒插入重排

该突变是由基因枪转入的两个质粒引起的基因片段插入。

通过组装的contig1884（Fig.4横坐标）与质粒pAZ132和unc-119的结构（Fig.4纵坐标）进行共线性比对。结果显示，转基因造成的插入，共包括3个拷贝的Ppie-1::GFP::H2B::pie-1和2个拷贝的unc-119(+)（局部）。

Fig.4 contig1884与质粒pAZ132和unc-119间的共线性分析

3.组装出了2个细菌基因组完成图

顺便提一下，研究人员在组装线虫基因组的同时，还装出了2个完整的细菌基因组(Fig.1中的contig14和20），经过比对数据库分析，认为细菌来源于线虫培养基，在提取线虫DNA时未被去除。

这提醒我们，如果是de novo组装基因组，尤其是小型动物，昆虫等物种，须尽可能减少环境微生物和肠道微生物的影响。

当然这也给了我们另一种启示，可以用Oxford Nanopore 技术研究微生物与宿主间的共生关系，研究一个物种的内外微环境等等。

本文利用Oxford Nanopore测序技术提升了线虫参考基因组组装指标，通过de novo组装研究了突变型线虫基因组的复杂染色体重排。另外我们还可以借助该技术的长读长优势，进行群体间（不同表型间），亚种间（例如不同品种的玉米），种间（例如研究在基因组加倍化事件后趋异的染色体重排，进行物种进化起源分析）等，各水平的比较研究。

继基于Oxford Nanopore测序技术的人全基因组数据发布后，人转录组RNA直接测序数据也已于2017年11月30日在github上发布^[1]。此前已为大家分享过全基因组数据分析结果（Nanopore测序组装人类基因组初探），今天组学君为大家呈上Nanopore除了ultra-long reads之外另一个amazing的创新点–direct RNA测序应用于人转录组的研究。

结论

01

direct RNA测序能够评估poly-A的长度

poly-A的长度属于可变聚腺苷酸化（APA）的一种，可能与mRNA的稳定性和3’UTR区参与基因表达调控机制相关^[2]，Nanopore direct RNA测序能够评估poly-A长度，为研究3’UTR区的重要生物学意义提供一种新方法。

通过在Nanopore direct RNA测序时添加已知参照物SIRV，并对其进行polyA长度分析，中值在20-30nt之间，与预期相符，说明使用Nanopore direct RNA测序评估polyA长度的方法有着很高的准确度。

02

direct RNA测序能完整重构isoform，为研究可变剪接、融合基因提供基础

发布数据的链接中^[1]，展示了利用Nanopore技术测序对人转录组中Dystonin gene和p53gene进行外显子连接和isoform重构。

03

direct RNA测序能直接检测RNA表观修饰

RNA的表观修饰研究的兴起，可能也就是近5年的事情，gold rush才刚刚开始^[3]。与以往其它技术不同，direct RNA测序能够直接将RNA表观修饰的信息以电流变化信号记录下来，通过相关算法来识别。发布数据的链接中^[1]，展示了在E. coli 16s rRNA中检测到m7G 和假尿苷修饰的证据。

研究人员期望通过direct RNA测序将RNA所有的表观修饰准确地检测出来，包括tRNA。

参考文献和链接

[1]https://github.com/nanopore-wgs-consortium/NA12878/blob/master/RNA.md

[2]Subtelny, Alexander O., et al. “Poly (A)-tailprofiling reveals an embryonic switch in translational control.” Nature508.7494 (2014): 66-71.

[3]Willyard, Cassandra.”An epigenetics gold rush: new controls for gene expression.” Nature542.7642 (2017): 406-408.

基因组结构变异（structural variation），包括倒位、易位、重排、拷贝数变异等，影响基因组的稳定性、相关基因的表达调控，进而决定物种表型。研究基因组结构变异对分析动植物的进化起源，遗传育种和人类的健康及优生优育有着重要的意义。

在二代测序时代，1 kb~3 Mb亚显微水平的基因组结构变异一直受限于测序技术的短读长，无法得到准确地解析。进入到三代测序时代后，测序读长由几百bp上升到数十Kb以上，终于为基因组结构变异检测分析提供了更好的选择。

目前新兴的Nanopore测序技术，更是将最长读长提升到1Mb，研究人员遂将其应用到结构变异检测分析领域，以期更优质的表现。以下为大家解读这篇11月初发表在Nature Communications，基于Nanopore测序数据分析病人染色体碎裂重排病例的论文。

文中的两个病例（以下简称P1，P2）属于先天性发育不良，在2,7,8,9号染色体上发生了染色体碎裂重排（chromothripsis rearrangements），从核型分析（P1）可以看到9号染色体上的一段序列插入到了2号染色体中。

Fig.1 P1的核型分析

研究人员对P1和P2进行了低深度的Nanopore全基因组测序（11-16×），建立起基于Nanopore测序数据进行结构变异分析的pipline:NanoSV（Fig.2），同时以Illumina数据进行对比，构建基因组SV图谱（Fig. 3），对比了Illumina和Nanopore多种SV检测算法，并对P1的双亲进行了Illumina测序，用以后续进一步phasing。

2SV检测

基于Illumina测序数据，从P1中能检测到40个de nove染色体碎裂重排，并得到了PCR和Miseq验证（Fig.3）,而基于Nanopore测序数据进行NanoSV分析，也检测到同样的SV，优于其它算法，如Lumpy, Sniffles（Fig.4）。

Fig.3基因组SV图谱

Fig.4 Illumina及Nanopore多种SV检测算法比较

在P2中，Illumina检测到29个de nove染色体碎裂重排，而NanoSV检测到24个，为了找到NanoSV为什么会 “miss” 掉5个SV的原因，研究人员进行了一代验证，原因可能是因为染色体发生了非常复杂的多位点断裂重排（Fig.5），而Illumina数据并未能准确地还原整个过程。

Fig.5 复杂的多位点断裂重连位点图例

对比Nanopore和Illumina的覆盖度受基因组GC含量的影响，发现Illumina存在很明显的GC bias，而Nanopore的测序覆盖度受GC含量的影响较小。

Fig.6 Nanopore与Illlumina测序的GC偏好性比较

总得来说，基于Nanopore数据的NanoSV分析复杂的基因组结构变异，准确度高，与二代相比GC 偏好性低，属于更优质的选择。以下为基于NanoSV分析P1 染色体碎裂重排的详细图解，在确定重排序列的顺序和方向方面，比Illumina更胜一筹(Fig.7)。

Fig.7 基于NanoSV分析P1染色体碎裂重排的详细图解

1Phasing

在二代测序时代，无法准确地区分等位基因，对SV变异也无法得知来自哪个亲本。而现在，借助于Nanopore测序的超长读长，通过更好的overlap关系，能更好地进行phasing。本文中，研究人员建立了一个pipline，通过结合分析Illumina数据的杂合SNPs和Nanopore reads，比对回亲本参考序列，准确地证实P1中的染色体碎裂起源于父亲(Fig.8)。

Fig.8  染色体碎裂中断裂重连的phasing

最近流行的Nanopore测序技术，最长读长高达1Mb，长读长在结构变异检测分析领域优势明显，不仅能灵敏地检测到结构变异，更能准确分析出重排的顺序、方向，还有助于探寻变异来源。

参考文献

MJ van Roosmalen, MC Stancu, I Renkens, et al. MappingAnd Phasing Of Structural Variation In Patient Genomes Using NanoporeSequencing[J]. Nature Communications, 2017

多倍体化事件增加了基因组的复杂性，帮助克服极端环境，是推动植物进化的主要动力，在物种的演化过程中起了举足轻重的作用。然而多倍体物种的转录组分析，长久以来受限于二代测序读长偏短，不仅无法准确重构转录本，更无力探究各亚基因组间的isoform结构差异及基因如何选择性保留。

自PacBio全长转录组测序不断普及，以及高粱和玉米两篇全长转录组文献高调亮相Nature Communications引起广泛关注，研究人员开始尝试将这种新技术应用到多倍体物种的转录组研究中，以下是几篇多倍体物种PacBio SMRT 全长转录组文献统计，供大家参考。

本次为大家解读四倍体阿拉比卡种小粒咖啡(2n=4x=44)全长转录组文献[3]，感受“全长转录组测序让多倍体物种isoform重构和亚基因组phasing不再是难题”。

阿拉比卡种小粒咖啡（Coffea arabica）为世界上最为广泛种植的咖啡品种，是由C.canephora和C.eugenioides杂交并基因组加倍形成的异源四倍体，其两个祖先种在味道、咖啡因含量、生存环境等方面有着显著的差别。C. arabica虽风味口感优质但对种植环境要求高、抗病虫害能力较弱，因此研究亚基因组基因表达调控，利于培育不仅美味而且更易种植的品种。

1材料与方法

随机选取Coffea arabica var. K7品系的不同植株，不同部位，不同发育阶段共计450 个果实。经样本前处理、RNA提取，反转成cDNA后，根据PacBio Iso-Seq protocol，分片段构建Pacbio RSⅡ文库并测序。（目前新一代PacBio Sequel测序仪可构建不筛分片段的转录组文库，更接近真实地还原物种转录本片段分布情况）

通过转录组注释、同源基因比对、候选基因筛选等一系列生物信息分析，筛选出与咖啡因、蔗糖合成相关的基因的isoforms，并与相关数据库比对。

2研究结果

咖啡因合成途径中isoform多样性

咖啡因的合成途径前期已有广泛的研究，已有比较完善的数据库提供候选基因和编码序列信息（转录组和基因组数据都有），在这篇四倍体小粒咖啡的论文中，研究人员找到了10个可能与咖啡因合成相关基因的高质量isoforms，并且发现这些isoforms都发生了5’非翻译区延伸。

Table1 咖啡因合成途径相关候选基因注释，isoforms及5’非翻译区延伸情况

这10个isoforms中，有9个比基因组DNA序列长，而有一个isoform可能因为发生了可变聚腺苷酸化(APA)而短于基因组DNA序列(Fig.2 c)，在3‘UTR检测到2个潜在的APA信号(Fig.2 d)。

Fig.2 一个isoform(c25904/f2p0/977)可能因APA事件而短于基因组DNA序列

这些咖啡因合成相关的基因也存在可变剪切现象（AS），以下为DXMT2基因内含子保留AS示例(Fig.3)。

Fig.3DXMT2基因内含子保留AS示例

异源四倍体小粒咖啡转录组的isoforms表现出较明显不同的亚基因组来源，通过与已发表的祖先种之一C. canephora的转录组数据进行比对，XMT1、MXMT1、DXMT2基因的isoforms与C. canephora的isoforms有较好的一致关系，表示这些isoforms可能来源于C. canephora亚基因组；相反，XMT2、MXMT2、DXMT1与C. canephora的isoforms比对率不高，表明他们可能来源于另一个C.eugenioides亚基因组。

通过重构isoform初探复杂多倍体亚基因组的基因表达

通过PacBio 全长转录组测序，可准确地重构小粒咖啡的转录本信息，以蔗糖合成途径中非常重要的基因SS1为例，研究人员发现了9个转录本异构体，包括替换、缺失、内含子保留等多种可变剪接形式。

Fig.4 蔗糖合成相关基因SS1多种可变剪接形式

随后，同样通过与祖先种之一C. canephora的转录组数据进行比对，分析比对率和相同的核苷酸变异（Fig.5），以此推断单个isoform来源于哪个亚基因组。例如Fig.5中第1行（标黄）为祖先种之一C. canephora SS1基因序列，将小粒咖啡的多个isoforms的一致性序列与其进行比对，第2-5行的isoforms与C. canephora表现出高度的一致性，并共同在3,726 bp处有一个A-G的碱基替换，与第6-10行相比，在3,707bp、3,733bp处有着同样的inset、在3,713bp、3,715bp处有着同样的碱基替换，以此将isoforms的来源区分开。

Fig.5 SS1基因多个isoforms一致性序列中的碱基变异比较

第二个有力的证据是，第6-10行的isoforms与C. canephora相比较，在内含子10区域，有着更高的变异。

另外还可以通过等位基因加以佐证。

可变剪接、可变聚腺苷酸化、5’UTR延伸、亚基因组拷贝数这些因素的综合作用，形成了转录本的多样性，本文以咖啡和蔗糖合成途径相关基因为例，以PacBio SMRT长读长测序为技术手段，完成四倍体小粒咖啡 isoforms重构和亚基因组复杂、多样的基因表达研究，为其它多倍体物种基因表达调控研究提供参考。

未来组凭借率先引进PacBio Sequel平台的优势，已完成十余个多倍体动植物转录组测序分析，在多倍体物种isoforms重构和亚基因组phasing方面经验丰富。

引用文献

[1]Clavijo B J, Venturini L, Schudoma C, et al. An improved assembly and annotation of the allohexaploid wheat genome identifies complete families of agronomic genes and provides genomic evidence for chromosomal translocations[J]. Genome research, 2017, 27(5): 885-896.

[2]Wang M, Wang P, Liang F, et al. A global survey of alternative splicing in allopolyploid cotton: landscape, complexity and regulation[J]. New Phytologist, 2017.

[3]Cheng B, Furtado A, Henry R J. Long-read sequencing of the coffee bean transcriptome reveals the diversity of full-length transcripts[J]. GigaScience, 2017.

依据当前高通量测序技术发展，虽说现在仅花费几小时就可以组装出细菌基因组的完成图，但是你是否打开脑洞的想过，我们是否可以不组装，只需要1条read就可得到细菌基因组的全部信息？现在，Nanopore纳米孔测序的超长读长给了脑洞成为现实的可能。

当然，目前一条read就可测得一株细菌基因组信息的脑洞还没法立刻成为现实，但已有研究者通过优化样本提取、建库和上机条件后，可通过nanopore测序数据中的一条read覆盖全基因组序列的1/6。

优化流程

对过夜培养的E. coli K-12 MG1655 经Sambrook protocol提取，得到高分子量DNA（>60Kb），OD260/OD280 =2.0

通过前期测试经验，将建库起始量调整至20ug

最后，文库加载到1个标准的FLO-MIN106 flowcell (R9.4) 上机测序。

下机数据

最后下机总数据量为5,014,576,373bp，共150,604 条read，read N50为63,747bp，平均read长度为33,296bp。其中，前面最长的10条read分别为1,113,805bp， 916,705bp， 790,987bp， 778,219bp， 771,232bp， 671,130bp， 646,480bp， 629,747bp， 614,903bp， 603,565bp。

Figure 1E. coli K-12 MG1655下机数据读长分布

数据比对

经GraphMap工具将数据集比对到参考基因组，其中95.46%的序列可比对到参考基因组上，平均比对读长高达34.7Kb。

前面最长的10条比对读长分别为778,217bp， 771,227bp，671,129bp，646,399bp，603,564 bp，559,415bp，553,029bp，494,330bp，487,836bp，470,664bp，从理论上来说，7条最长的reads就可对4.6Mb大肠杆菌基因组进行覆盖。

Figure 2E. coli K-12 MG1655数据比对后读长分布

Nanopore测序技术中无PCR，无DNA合成，最终得到read长度很大一部分取决于文库模板DNA长度和质量，因此对DNA总量、纯度、完整性要求严格。

参考文献

Loman, N. J. Thar she blows! Ultra long read method for nanoporesequencing accessed 2017-05-08.