研究者在马里亚纳海沟多个位置捕获到MHS，体型形状与生活在浅海区域的Tanaka狮子鱼相似，但是MHS表皮透明可以清晰的看到腹腔内的肌肉和内脏（图1a,b）。此外MHS还表现出其他适应深海环境的形态特征，比如扩大胃，肝脏和卵子，更薄的肌肉和不完全骨化的骨骼。

图1. MHS与Tanaka’s snailfish形态对比

利用PacBio第三代单分子实时测序技术以及二代Illumina对MHS进行测序，最终获得了684Mb的高质量MHS基因组，scaffold N50为418Kb。BUSCO数据库评估表明基因组的完整性为91.7％，与其他硬骨鱼类的完整性相当。研究者还对15个组织的28个样本进行了转录组测序，超过89%的转录本序列能够比对到基因组上，进一步验证了组装基因组的完整性。同时，研究者还对浅海狮子鱼Tanaka进行测序组装，结果发现MHS比Tanaka的基因组大了150 Mb（约21.9%），这可能主要是由于MHS基因组中重复序列的扩展造成的，而MHS基因组的其他特性，包括其GC含量，密码子，基因长度和外显子数与Tanaka中的相似，暗示它们可能不是导致MHS能够适应深海环境的因素。

研究者利用9种硬骨鱼类的蛋白质序列（MHS，Tanaka，棘鱼，河豚，阔尾鱼，鳕鱼和斑马鱼，比目鱼和太平洋蓝鳍金枪鱼）构建系统发育树（图2a），发现MHS和Tanaka在大约2,022万年前发生了分化，这比马里亚纳海沟的形成时间早了1,000万年。对两个物种的动态有效种群大小（N_e）的估计表明，MHS的种群数量大于Tanaka种群，并且在大约5万年前经历了显著的种群扩张。MHS种群相当大，具有丰富的遗传多样性。

在这9个物种中，MHS具有最低的突变率（图2c），全基因组水平MHS的突变率也低于Tanaka和棘鱼（图2d）。研究表明突变率对多种因素特别是世代时间敏感，同时观察到雌性MHS产生的卵子数量少于其他种类狮子鱼的雌性，因此，MHS较长的世代时间可能与其低突变率相关。

图2. MHS的进化历史

生活在地球表面的脊椎动物已经闭合了由硬骨包围的颅骨空间，以保护大脑并维持适当的颅内压。然而，封闭的头骨在非常高的环境压力下不能保持其结构完整性，大多数深渊动物都是无骨生物。MHS却是个例外，使用计算机断层扫描发现MHS的颅骨未完全闭合（图3a,b）这使得其可以平衡内外部压力，更重要的是MHS的大部分骨骼是软骨。研究发现MHS的骨钙素基因bglap，发生了移码突变（图3c）,作者利用斑马鱼（Danio rerio）为实验材料，通过抑制bglap基因的表达结合钙黄绿素染色（图3d-g），证明了bglap提前终止可能与MHS不寻常的颅骨结构和骨骼硬度降低有关。

接着对MHS的晶体蛋白和视蛋白基因的变化进行了比较基因组分析，发现它已经失去了几个重要的光感受器基因，并且色素沉着基因mclr在该物种中完全丢失。这些结果与MHS对深海探测器的灯光没有反应，失去了皮肤色素沉着，变得透明等表型特征相适应。

图3. MHS不完整的颅骨与骨钙素(bglap)基因的过早终止表达有关

众所周知，细胞膜是含有磷脂双分子层和蛋白质的可流动结构。而深海极高的静水压降低了脂双层的流动性和相变可逆性，最终导致膜相关蛋白的变性和功能失调。对9个硬骨鱼基因家族分析发现，MHS中与脂肪酸代谢相关的基因家族显著扩增。深海适应生物比浅海生物的膜含有更高含量的不饱和脂肪酸，其中二十二碳六烯酸（DHA）可以显著改变膜的芳基链顺序和流动性，渗透性和高压下的蛋白质活性。Acaal基因编码的蛋白质是DHA合成过程的限速酶，研究者发现MHS基因组有15个acaal基因拷贝，而所有其他完全测序的硬骨鱼类只有5个拷贝，同时参与DHA生物合成的另一个基因fasn也在MHS基因组中表现出拷贝数增加。这些变化可能会增加生物膜液体脂质的丰度，使其适应深海的高静水压环境。

其他显著扩展的类别包括具有离子和溶质运输功能相关的基因家族，这提供了揭示MHS适应极端静水压力的线索。GO分类表明相比Tanaka，MHS中“离子转运”，“跨膜转运”和“钙离子转运”蛋白进化速率显著增加，这些基因谱系的特异适应性进化可能与膜转运系统活性有关，帮助鱼在高压下茁壮成长。

图4. MHS基因组的基因家族扩展与适应性进化

静水压通过影响蛋白质折叠和酶活性抑制其功能。生活在很深处的物种必须保持细胞内环境，抵抗高压，维持蛋白质结构特性。目前有两种机制解释深海生物蛋白质活性维持，分别是生理适应和结构适应。

Trimethylamine N-oxid（TMAO）是一种生理上重要的蛋白质稳定剂，可以将变性蛋白质恢复到其天然结构。大多数硬骨鱼类基因组含有5个拷贝的TMAO合成酶——黄素单加氧酶3（fmo3），其中4个是串联重复序列（图5a），而第一个拷贝fmo3a基因在MHS的肝脏中强烈表达，并且fmo3a在MHS中被正向选择。作者预测MHS中该基因上游有5个拷贝启动子比浅海狮子鱼（1个拷贝）或棘鱼（2个拷贝）更多。这些发生在基因编码及调控序列的变化可能有助于MHS增加细胞内TMAO水平以增强蛋白质稳定性。

蛋白质对深海条件的结构适应包括氨基酸取代模式和蛋白质结构的改变，MHS与其他物种的氨基酸组成和所有编码基因的替换相互比较，所有蛋白质中不存在全局性的组成和替代变化。进一步对各基因家族聚合氨基酸取代进行分析，仅有hsp90基因表现出高可信度的聚合氨基酸变化——在MHS的hsp90蛋白5个拷贝中，有4个独立地发生了同样的丙氨酸-丝氨酸取代，这一位点在人类、小鼠、鸡、变色龙和酵母的相应蛋白质中是高度保守的位点（图5b）。Hsp90是一种进化上保守且高度丰富的分子伴侣，可促进200多种蛋白质的正确折叠和活化。四个MHS hsp90亚型同源性建模发现在相对保守的基序FYSSX中具有丙氨酸-丝氨酸突变，并且所有突变的丝氨酸都位于ATP结合袋附近，并可能对影响hsp90活性的局部结构相互作用有重要影响（图5c）。

图5. 在MHS中增加蛋白质对静水压力的稳定性

总 结

研究者利用深海探测器在马里亚纳海沟首次发现狮子鱼Pseudoliparis swirei，也是目前我国在深海获取样本的最大深度（7，415m），该研究解析了脊椎动物适应深海海沟极端环境的遗传基础：

1. 形态学分析发现，与浅海区域的Tanaka狮子鱼不同，P. swirei具有一系列适应深海生活的特征如透明的皮肤，膨大的胃部，不完全骨化的骨骼以及非闭合性颅骨。

2. 系统发育分析表明，大约2000万年前，P. swirei与居住在海面附近的近亲分开，具有丰富的遗传多样性。

3. 基因组分析显示：

a) 骨钙素基因（bglap）具有移码突变，可能导致软骨钙化的早期终止;

b) P. swirei的细胞膜流动性和转运蛋白活性可能因蛋白质序列和基因改变而增强;

c) 三甲胺N-氧化物（TMAO）合成酶和hsp90伴侣蛋白中的关键突变可能增加了其蛋白质的稳定性。

本研究中发现的众多遗传变化揭示了脊椎动物物种如何在深海中生存和繁衍，提供了对脊椎动物的形态，生理和分子进化新的见解。

参考文献

Wang K, et al., Morphology and genome of a snailfish from the Mariana Trench provide insights into deep-sea  adaptation. 2019. Nature Ecology & Evolution, https://doi.org/10.1038/s41559-019-0864-8.

2019年4月2日，中国农业科学院果树研究所与武汉未来组等单位共同合作的研究成果“A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour”发表于国际顶级期刊Nature Communications。中国农业科学院果树研究所张利义副研究员与未来组生物信息研发总监胡江为本文并列第一作者，中国农业科学院果树研究所丛佩华研究员与未来组创始人汪德鹏为本文共同通讯作者，武汉未来组的李净净，田玉等四人为本文共同作者。本研究以来源于花药的苹果纯合系HFTH1为材料，采用三代PacBio测序技术，结合光学图谱Bionano和Hi-C技术辅助组装，获得高质量苹果基因组图谱(contigN50为6.99Mb，2017年发表的苹果基因组contigN50为620kb)。有趣的是，进一步研究发现花青素生物合成的核心转录激活因子MdMYB1上游UTR区域的一个LTR反转录转座子的插入与果实红色相关联。本研究为探讨红色果实着色的分子机制提供了重要见解，同时突出了高质量的基因组组装在破解苹果重要农业性状中的实用性。

苹果基因组是苹果遗传研究和分子育种的基础，可推动苹果的可持续生产。尽管早前发布的高质量金冠（Golden Delicious）基因组使苹果育种研究取得了一些进展，但仅仅利用这些数据在发现新基因和描述基因组结构变异方面仍存在一些局限性。

在中国北方地区广泛栽培的寒富（Hanfu）品种是高度杂合二倍体，经过花药体外培养的纯合子植株HFTH1（三倍体）大大降低了杂合度（Fig.1）；通过对相应Illumina reads进行SNP calling，发现与先前发表的双单倍体金冠（GDDH13）相比，HFTH1的纯合度更高（Fig.2），高度纯合的基因组有利于提升基因组组装质量。

Fig.1花药培养再生植株HFTH1表型与杂合子供体(HFP)基因型的显著变化

Fig.2 GDDH13及HFTH1基因组中的SNP数量

对~117× PacBio数据（平均读长13.1 kb）进行初步组装，获得了一个初步组装结果：基因组大小656.52 Mb，Contig N50 4.63 Mb；随后使用PacBio长reads及Illumina 数据对组装结果进行polish；应用~224× Bionano光学图谱数据将polish后的contigs组装成scaffold；随后，应用145× Hi-C数据进行精确聚类并排序，最终组装出一个高质量的苹果基因组，包含17条模拟染色体（Fig.3a，3b），基因组大小658.90 Mb，contig N50 of 6.99 Mb；此外，还将160,068 bp叶绿体基因组和396,939 bp线粒体基因组组装成完成图。

Fig.3 (a)17条染色体间的Hi-C互作图（100-kb resolution）；（b）HFTH1基因组特征

本研究组装的HFTH1基因组在7条染色体的两端和8条染色体的一端共捕获22条长端粒序列（拷贝数从294到1073，Fig.3b）。BUSCO评估基因完整度达到~97.0%，覆盖公共数据库Malus domestica基因组中98.02%的ESTs。将组装结果进一步与水稻基因组（RGAP7）和拟南芥基因组（TAIR10）比较，发现HFTH1基因组BUSCO评估与两者都很接近，表明我们组装的基因组完整度达到模式植物的水平。

种植园结出的草莓香甜美味，一直是广受世界各地消费者喜爱的水果，但是小伙伴们知道吗？和野生的四倍体东方草莓或者人工诱导的八倍体小黑麦不一样，栽培草莓中含有天然的八套异源染色体组！有意思的是，融合成为这八倍体基因组的四个二倍体物种，其中两个已经鉴定出来了，而另外两个至今仍然是谜，这就导致八倍体草莓形成的历史进化过程也扑朔迷离。

大家都知道蔷薇科是双子叶植物中的大类，其中的草莓属已有22个种为人们所熟知，因其倍性水平内部和之间的高度可杂交性，自然呈现出从二倍体乃至十倍体的多样性。相较于同源多倍体，异源多倍体更容易呈现多样化的农艺性状，且其中每个亚基因组都包含一个在单核内进化独立的遗传和表观遗传，但是当前研究对亚基因组优势的潜在机制和终极导向还不甚明朗。

由于大尺度的染色体改变和同源基因的交换导致了亲本染色体之间同源基因的乱序和替换，使得异源多倍体系统的分析无法很好的将亲本基因拷贝分配到每个亚基因组上。而选择八倍体草莓则有如下两个优势。一，其四套亚基因组仍包含完整的同源染色体子集，大大简化了同源染色体的分配；二，二倍体祖先物种现生近缘种的基因序列（可能仍存在与八倍体草莓中）能用于将同源染色体精确划分到各自亲本亚基因组中。同时，要充分利用草莓作为研究异源多倍体的模型系统，并为确定生物学和农业上重要的基因和应用基因组育种方法提供一个平台，需要一个高质量的八倍体参考基因组。

因此，本研究选取八倍体草莓通过PacBio、10×Genomics和Illumina等平台覆盖了615×的基因组数据，最终组装出0.81G的基因组、包含28条染色体水平的pseudomolecules，约占到预估基因组大小的99%，同时使用其遗传图谱进行校错并通过野草莓（Fragaria vesca）进行同源染色体鉴定。

研究者还注释了108087个编码蛋白的基因以及30703个编码长链非编码RNAs(LncRNAs)的基因，并在注释中鉴定到了高等植物数据库中99.17%的核心基因（1440个），证实了组装的优质。另外，研究也进行了重复元件如DNA转座子、LTR-RTs以及非LTR反转录转座子等的注释，分析发现转座元件（TE）占到了基因组约36%，而其中LTR-RTs丰度最高，占约28%。最后，对质体和线粒体基因组的组装注释也体现了组装的完整度。

图1 二倍体和八倍体草莓基因组的共线性（a. 本研究中的八倍体草莓和二倍体的F. vesca基因组宏观共线性比较，红色为F. vesca，紫色为F. nipponica，蓝色为F. iinumae，F. viridis 是绿色；b. 1号染色体四个同源拷贝的基因保留模式，颜色编码同a。c. 二倍体F. vesca和八倍体草莓的四个同源区在1号染色体某区域上的微观共线性比较）

系统发育分析最重要的切入点其一是物种的选取具有代表性，其二是包含足够的遗传信号。本研究从头组装了31个已描述的二倍体草莓转录组，预测出了19302个直系同源核基因用于鉴定祖先种，是草莓属目前遗传信号最丰富的分子系统发育分析。

①研究揭示了前人未知的两种二倍体祖先，结合地理分布、历史事件和遗传印记推断出了八倍体草莓形成的过程，详见图2。

图2 八倍体草莓的进化历史（图中标识了八倍体草莓的二倍体祖先现生亲缘种、推断的中间四倍体、六倍体祖先和北美现生八倍体野生种，每种二倍体祖先颜色和图1一致）

②系统发育分析表明Fragaria iinumae和Fragaria nipponica是四种现生二倍体祖先的其中两个种，为日本特有，在地理分布上毗邻中国的所有五个四倍体种。

③第三个为分布于欧亚的二倍体Fragaria viridis，与独有的六倍体种Fragaria moschata在分布上部分重叠，研究据此假设四倍体和六倍体是从二倍体到八倍体进化的中间产物，该假设也得到了之前研究的支持。

④研究鉴定到的第四个种为F. vesca subsp. Bracheata，仅分布于从墨西哥到不列颠哥伦比亚的北美西部。

⑤系统发育结合现存种的地理分布推断八倍体草莓起源于北美，而F. vesca subsp.Bracheata极有可能贡献了八倍体草莓形成的最后一个二倍体。该发现与之前研究一致，也得到了本研究卡麦罗莎（美国二十世纪九十年代育成草莓品种，长势健旺）质体基因组分析的证实。因此，可以推断六倍体祖先可能从亚洲传入北美并在约1.1个百万年前与F. vesca subsp. Bracheata的当地种群杂交。

大部分古老的异源多倍化事件后，其中一个亚基因组通常会呈现主导优势，如基因含量更高、高表达以及更强的选择压力等，且和亚基因组含量的差异及TEs（转座元件）调控相关（基因表达水平与其附近的TEs密度呈负相关），因此可以基于TEs富集和分布来预测基因表达优势和单个同源染色体水平上最终的基因缺失。

基于上述鉴定的二倍体近亲，研究对四个亚基因组进行了动态分析，鉴定出F. vesca祖先种为优势亚基因组的供体（见图1），保留了多出20.2%的蛋白编码基因和多出14.2%的lncRNA基因，并比其他同源染色体少了19.5%的TEs。相较于其他亚基因组，F. vesca同源染色体基因附近的TEs密度也最低，同时其串联基因重复也多出约40.6%等。这些都表明了F. vesca亚基因组承受了更多的选择压力以保留基因，包括串联重复基因。

研究还分析了影响草莓产量的疾病抗性基因（R genes）。进来研究证实很多R蛋白通过整合的诱饵结构域（decoy domains）识别病原体效应物，而F. vesca基因组编码了20个这种蛋白模型。八倍体草莓扩张了105个融合到R蛋白结构上分化的结构域且具有潜在的整合诱捕功能。

另外，研究还发现不同于F. vesca祖先种，其他祖先种染色体部分区域保留了更多的祖先基因，这些区域是同源染色体交换（HEs）或基因转化事件的产物。值得注意的是，大部分八倍体草莓的HEs涉及显性F. vesca亚基因组对应区域的同源染色体替代。如系统发育和比较基因组分析显示相对F. iinumae，HEs呈现7.3×的偏向于F. vesca亚基因组，但它们并不是像以前报道的那样是单向的。这些结果都表明，F. iinumae亚基因组部分已被F. vesca亚基因组所取代。当然，结果也表明F. vesca亚基因组在草莓抗病性上起主要作用，同时其他三个二倍体祖先种也贡献了抗性机制的多样性。

最后研究还进行不同器官的基因表达分析，而结果证实显性F. vesca亚基因组确实有更高的表达，也支持了亚基因组表达优势受亚基因组之间TEs密度差异影响的观点（图3）。

图3 亚基因组表达优势（灰色柱状图是所有可测试的同源对的表达偏倚，即HEB，可测试的同源对标准基于共线性、＞80%的系统发育自展支持率以及转录组数据中至少包含一条read来判定；红色表示同源对显著偏向F. vesca同源基因，偏向三个二倍体祖先种中的一个则用黑色表示）

此外，研究还揭示八倍体草莓中的大多数HEs最终都会导致显性F. vesca亚基因组替代其他亚基因组其中一个对应的同源区域。因此，图3中观测到的F. vesca亚基因组同源基因表达倾向低估了转录组范围的表达优势（占所有转录本的68.7%）。这种偏向导致某些生物学通路如本研究中包括草莓风味、颜色和香味等的代谢通路很大程度上由一个显性亚基因组控制。

DNA甲基化是一类重要的表观遗传修饰，除真核生物外在多种原核生物中也有发现，如保护宿主细胞免受噬菌体或细胞外DNA入侵的序列特异性限制性修饰（RM）系统，已经成为生物技术研究的重要工具。

此外，原核DNA甲基化还有调节基因表达、错配DNA修复以及细胞周期等功能。但是，目前大部分研究者仅局限于实验室可培养稀有原核生物的研究上，因此对原核生物甲基化系统多样性的了解知之甚少。基于单分子实时测序（SMRT）技术的PacBio平台可以说是DNA甲基化研究者的新宠，像原核菌株中的N6-methyladenine (m6A),5-methylcytosine (m5C)和 N4-methylcytosine (m4C)等修饰都已有使用该技术进行解析的案例。尤其是其环状一致性（CCS）测序模式能够对同一模板生成整合多条序列的单条超长read，从而无需进行无性系种系培养，目前CCS仅用于部分鸟枪法宏基因组研究，还没有应用到宏表观基因组或环境微生物群体的直接甲基化分析上。

近日，来自东京大学的Satoshi Hiraoka等人使用PacBio CCS技术研究日本最大的淡水湖——琵琶湖微生物群落的鸟枪法宏基因组和宏表观基因组，绘制了19个细菌和古细菌草图基因组，并揭示了22种甲基化motifs，其中9种是首次发现，还通过计算预测和实验验证了与之相关的4种甲基转移酶（MTases），其中2种被发现能够识别新的motif序列。该研究表明宏表观基因组作为一种强大的方法可用于鉴定自然界中未探索的多种原核DNA甲基化系统，研究成果发表在Nature Communications上。

采样测序和分类分析

采集琵琶湖不同深度水样，PacBio测序得到的数据和环状一致性分析统计见表1，其中90%的CCS reads都是高质量的。

通过Kaiju和NCBI数据库对CCS reads进行分类，结果见图1。其中，＞88%鉴定到门，＞56%鉴定到属，高于同样计算方法的基于Illumina测序的鸟枪法宏基因组。在门水平上，变形菌门在两种样本中均占主导，其次为放线菌门、疣微菌门和拟杆菌门(Fig.1)。绿弯菌门和奇古菌门在深水中尤其丰富，古生菌在浅水中尤其稀少。后鞭毛生物为最优势的真核生物，其次为囊泡虫总门和不等鞭毛类。而病毒中占优势的依次为有尾噬菌体目和藻类去氧核糖核酸病毒科。研究结果与之前淡水湖微生物群体研究一致，表明PacBio平台和短读长测序技术平台一样适合进行宏基因组分析。

图1 CCS reads的系统发育分布，a、b、c分别代表域、门、纲的富集推断，忽略真核生物和病毒reads

宏基因组组装和基因组binning

研究从浅、深水中分别组装出554、345条contigs，对应的N50为83kb和76kb，最长contig分别为481kb和740kb，远远超过了之前将CCS应用于鸟枪法宏基因组分析活性泥微生物群体的组装结果。然后使用MetaBAT进行binning，浅水和深水分别有52.3%和29%分配到15个和4个bins上，且有46.9%和44.8%的CCS reads可以map到草图基因组上（见图2和表2）。

图2 对组装的contigs进行基因组binning。每一种颜色和大小的圆圈代表所属的bin和序列大小。

对每个bin进行草图基因组组装，基因组完整性在17%-99%之间，污染均低于3%，基因组大小在1.0-5.6Mb之间，GC含量从29%-68%，平均N50为24kb，最大1.67Mb。19个草图基因组划为7个门，其中7个推断为放线菌门、4个为疣微菌门，另外，最丰富的变形菌门只在浅水中装出2个草图基因组，深水甚至没有装出来。总之，系统发育重建很可能反映出了琵琶湖中优势、但尚未培养的微生物谱系。

宏表观基因组分析

从10个草图基因组中检测出29种候选甲基化motifs，甲基化比例从19%-99%（可能低于真实的甲基化水平），见表3，其map上的subreads覆盖度从28.7×到297.3×。

可能由于单个甲基化motif检测不完整或包含在该基因组中近缘谱系间的异质motif序列，变形菌BS12基因组中的3个motifs包含了相似的序列，而拟杆菌BS15基因组中则观测到了回文motif和5个互补motif对，值得注意的是，绿弯菌门的3个草图基因组——BS1、BS3和BD1共享相同的motif序列集，这可能是由于进化共享的甲基化机制引起。大体上，每个草图基因组的contigs都呈现相似的甲基化模式，也为基因组binning提供了表观基因组上的支持。

当然，也有至少9个motifs没有匹配上任何现有的REBASE序列上，这也暗示环境原核生物DNA甲基化体系中还存在着诸多没有被挖掘的多样性，包括一些没有培养过的菌株。

对应检出甲基化motif上的已知MTase

研究还尝试鉴定能够催化检出甲基化motif甲基化反应的MTase,对MTase基因进行系统性的注释。首先通过相似性搜索从9个草图基因组中鉴定到20个MTase基因，找到了丰度最高的Type II MTase等，以及编码REases等蛋白的基因，20个MTase基因中有7个和通过宏表观基因组分析的结果一致，见表3和表4。如奇古菌BD3基因组包含了两个MTase，和识别AGCT和GATCmotif序列的宏表观基因组分析结果高度统一，说明对于环境原核生物甲基化系统的鉴定，宏表观基因组分析是行之有效的手段。

未挖掘的原核生物甲基化系统多样性

20个MTases中也有13个和宏表观分析鉴定的酶序列不相似（表3和表4），说明揭示环境原核生物多样性甲基化体系也需要借助直接观测。研究以拟杆菌BS15基因组、疣微菌BS8、BS10和BS6基因组以及消化螺旋菌BD2基因组、变形菌BS12基因组等为例，从中均鉴定出数目不等的MTases和甲基化motif，但也都出现和报道的MTase或近缘MTasemotif序列不一致或完全匹配不上的情况，甚至也有检出甲基化motif但未检出MTase基因的个例。研究者推断可能的原因是基因组完整度不够，也有可能是这些MTase基因和可培养菌株中的MTase存在分化，还有可能是它们属于新的类群。

含新甲基化motif的MTases实验验证

对于宏表观基因组分析与motif序列高度相似的MTases，研究实验验证了其中四种的甲基化特异性，构建每一个携带人工合成MTase基因的质粒，转导到大肠肝菌细胞中强制表达，然后通过REase消化观察独立质粒DNA的甲基化状态，甚至个别还进行了PacBio测序来检测两个MTase基因各自转化的大肠杆菌染色体DNA甲基化情况。最后，研究鉴定出一系列新的、具有甲基化特异性的MTase基因，并对其表达的蛋白进行命名。

探索自然界中原核生物甲基化系统的
宏表观基因组

一系列的分析证实，PacBio SMRT测序结合CCS模式进行宏表观基因组的分析是非常有效的，较基于序列一致性和基于培养的甲基化系统分析以及短读长宏基因组分析都有显著的优势。

CCS reads让宏基因组组装、binning和基于序列的蛋白分类都变得更容易，最重要的是，该方法揭示了多个甲基化motif，包括环境原核生物中的一些新的motif和本研究中鉴定出的4种MTases。当然，由于需要更深度的覆盖，SMRT测序目前应用于更多种、更复杂样本的宏表观基因组还略显不足，检测到的DNA甲基化类型尚有限，但是要捕获足够的reads以构建稀有样本的长contigs并检测甲基化motif本身难度还是很大。同时，Oxford Nanopore也可以提供基于另一种原理的检测技术。

本研究充分说明即使亲缘关系极近的菌株之间甲基化motif和MTase也会有很大的差异，而且MTase除对抗噬菌体外，还发挥着不为人知的适应性作用。值得注意的是，宏表观基因组分析可以用于多种生物信息分析上面，也能够增进人们对环境原核生物甲基化机制及其应用的了解，而这里新鉴定的MTase也有其他生物技术上的应用。

怎么样？阅览了这篇文章，是不是认可了DNA甲基化多样性还需长读长技术来搞定呢？武汉未来组是中国最早一批引入第三代长读长测序技术的生物科技公司，基于多年的摸索研发经验，已经基于Pacbio CCS reads搭建了成熟的分析流程（见下图），完成了多个环境微生物宏基因组的分析项目，积累了丰富的经验。

未来组宏基因组分析流程