有了OPERA-MS，人体肠道微生物不用愁！

方法路径

 结果概述

从肠道微生物组CRE（Carbapenem–Resistant Enterobacteriaceae，碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌）定植的197个样本中提取DNA，28个样本的＞5Kb DNA文库在Nanopore上测序获得每个样本8G数据，且平均超过15%的序列＞5Kb，适合用于提高宏基因组连续性。同时，Nanopore文库的分类分布和Illumina高度一致。OPERA-MS使用了一种考虑了装配图和覆盖信息以优化聚类BIC的方法，通过现有的工具来精确定位基因组关键算法位点。

OPERA-MS工作流程（见图1）如下：

使用Megahit, metaSPAdes, IDBA-UD等短reads宏基因组组装工具初步组装contigs并覆盖长reads信息构建所有基因组的装配图；

使用无参聚类法在种水平解析基因组并使用有参法增加聚类；

鉴定亚种水平聚类、进行scaffolding并使用OPERA-LG补洞。

图1 OPERA-MS工作流程

重建混合宏基因组数据库近完整、高保真基因组

研究者为已知真实宏基因组的模拟群落组装了测序数据库，包含HMP交错模拟群落，然后评估了三种state-of-the-art宏基因组组装工具MegaHit，metaSPAdes，IDBA-UD，一种长reads组装工具Canu，一种混合组装工具hybridSPAdes以及一种宏基因组混合组装工具OPERA-MS的表现，涵盖了Illumina、PacBio、Nanopore和Illumina合成长reads四种测序方法下的37个组装完整的细菌基因组（见图2）。

图2 本研究中使用的模拟群落特征和数据

简要说来，研究者使用Illumina深度测序可以提升组装，但连续性不行；但是使用长读长数据则很好的解决了这个问题，在覆盖深度＞60×时，不仅跨越了重复区域，更获得了近完整的基因组。引人注意的是，Canu和hybridSPAdes需要＞30×数据达到的组装质量，使用OPERA-MS仅用~9×的长reads覆盖度就达到了。

相较于短读长方法，OPERA-MS和hybridSPAdes等混合组装方法能得到更高质量的序列，在序列质量和组装连续性上都优于仅用短读长或长读长的reads。

研究还比较分析了OPERA-MS和其他组装软件对于长reads覆盖的效用以及对每个基因组不同深度下组装连续性的相对提升。相对于短读长组装工具，OPERA-MS及metaSPAdes 、IDBA-UD、MegaHit只要在覆盖度＞1×就会显著提高连续性，在深度＞30×时，甚至还能提高十倍，尤其在深度＜5×时，OPERA-MS表现还超过了Canu。最后，研究者还注意到OPERA-MS在每1Mb时产生的错误组装＜1，优于错误率最高的hybridSPAdes 2.5倍。总之，OPERA-MS被证实对于各种长reads宏基因组数据库而言都是一款功能完备的软件。

模拟群落是评价宏基因组学常用的金标准。为了评估更加复杂群落的组装方法，研究者将模拟群落reads(GIS20)引入到了粪便宏基因组数据中来构建虚拟肠道微生物组。分析发现，即使群落多样性增加，在覆盖深度＞5×时，OPERA-MS还是表现出较之短读长组装工具5-10倍的连续性提升，而＜5×时则提升50%（见图3）。

图3 使用OPERA-MS和其他组装工具对不同深度数据组装连续性的提升

大家都知道binning（分箱）是将宏基因组数据中同一菌株的序列聚在一起得到一个菌株基因组，即一个bin（箱）。研究使用MaxBin2来分析短reads（MegaHit）和长reads（OPERA-MS）组装分箱的质量。OPERA-MS对基因组完整度中位数提升到95%，而MegaHit则提升到83%，20个中有4个OPERA-MS箱基因组完整度＞99%，MegaHit则为0。值得一提的还有，Canu能够利用＞100×reads组装出仅含12条contigs的、近93%的基因组，但是有53个重定位错误，相应的，hybridSPAdes也组装出10个重定位错误，而OPERA-MS组装出的是5个。OPERA-MS组装出了一种菌株99%的基因，包含了所有的抗生素耐药性基因且全部可以在一个高质量箱中找到。这些结果都显示OPERA-MS能够用于复杂微生物群落的研究且有能力区分亚种级别的基因组。

文章最后还对人肠道微生物组抗生素抗性和新移动元件进行了分析，由于篇幅关系摘其要点论述。如将OPERA-MS应用于Nanopore和Illumina测序的粪便样本，MegaHit组装基因组contig N50中位数＜9Kb，而混合组装提升了超过5倍，使用Nanopore长读长数据组装甚至提升超过了200倍（见图4）。

图4 使用Nanopore测序28个肠道微生物组组装概要

参考文献

Bertrand D,Shaw J, Kalathiappan M, etal.Nanopore sequencing enableshigh-resolution analysis of resistance determinants and mobile elements in thehuman gut microbiome . bioRxivpreprint first posted online October. 30, 2018.