Nature Biotechnology | Trio Binning——突破单倍型基因组组装难题

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婆罗门牛和安格斯牛在几千年前分别被驯化，并在此后受到了截然不同的选择压力：婆罗门牛遭受瘟疫和干旱环境的选择，而安格斯牛则被大量用于牛肉生产，这些不同的特性和历史反映在它们的基因组中，使它们成为理想的试验对象。

Table1 基因组组装情况

研究者指出，reads分类的准确性不仅与子代的接合性相关，还与测序的读长和准确度相关，因此k-mer大小的选择也很重要（Fig.3）。

Fig.3数据特性对trio binning方法的影响

研究者在拟南芥的杂交系中验证了这一方法。在一项已发表的研究中提供了两个拟南芥株系Arabidopsis thaliana Col-0和Cvi-0的F1子代的Illumina及PacBio测序数据。因为Col-0和Cvi-0都是高度近交系，因此其子代的单倍型被认为与亲本一致，是很好的验证材料。由于亲本没有二代短读长数据，所以研究者直接从组装结果中推断出单倍型特异性的k-mers，杂合度估计为1.360，即每73个碱基有一个变异，代表二倍体组装的最佳情况。验证结果显示，TrioCanu成功地将F1代reads分类，表现为k-mer单峰分布，且组装结果完全解决了亲本的单倍型（Fig.4）。

Fig.4拟南芥F1代的read 及组装k-mer数据特征

随后，研究者在一个欧洲家系中评估了这一方法（父亲：NA12891；母亲：NA12892；女儿：NA12878），并将NA12878的组装结果与Supernova 10x Genomics和FALCON-Unzip(PacBio)方法的组装结果进行比较。经k-mer分析，NA12878的杂合率约为0.1%，这给单倍体分型带来挑战，因为平均1000个碱基才有一个变异位点。基于trio binning的方法克服了这个问题，因为突变可以与其遗传的亲本相关联。

TrioCanu对72 x的PacBio数据进行组装，获得了NG50 为1.2Mb的单倍型，并分别组装出了2.7Gb的两个亲本的单倍体基因组（Table 1）。而从Supernova的41 x linked-read组装的contig NG50为103kb，phase block NG50 4.2 Mb。而基于FALCON-Unzip组装得到了较大的contig NG50，为8.7 Mb，但phase block NG50较短，为0.4 Mb。TrioCanu和Falcon-unzip模拟单倍型NGA50的大小分别为3.0和4.2Mb。TrioCanu生成了完整的单倍型，整个基因组处于同步状态，所有的单倍体都被分配给他们遗传的亲本。

Fig.5二倍体人类基因组单倍型变异

与Supernova相比，TrioCanu的组装结果的结构更准确——Supernova组装遗漏了许多的大的结构变异，且Alu和LINE indel的数量也比TrioCanu要少（Fig.5a）。同时研究者还通过分析在MHC区域（主要组织相容性复合物，是基因组中的高重复高杂合区域）的组装情况来确认其准确性。Supernova没有准确地组装出MHC单倍型，也没有捕捉到HLA-DRB3基因插入到父系单倍型中，并且错误地报告大部分MHCⅡ类区域为纯合子。而TrioCanu正确地组装了这两个MHC单倍型，表现在完美的HLA分型结果且分型基因中仅有一个碱基错误（Fig.5b）。

这些结果表明，trio binning是一种简便、准确、高效的二倍体参考基因组组装方法。该论文的作者之一John L Williams教授说，trio binning技术已经彻底改变了他们以前的技术，他说：“到目前为止，基因组序列都是由遗传差异最小的个体构建的。Trio binning技术标志着技术能力的重大进步，对研究和医学应用具有广泛的意义。” 并指出Trio binning技术将有助于建立更准确的个人基因组变异信息，这将提高基因测试的准确性，并有助于获得个人独特DNA序列，从而在其临床治疗上提供帮助^[2]。

参考文献

[1]Koren, S. et al. De novo assembly of haplotype-resolved genomes with trio binning. Nature Biotechnology (2018).

[2]https://sciences.adelaide.edu.au/news/2018/10/23/new-technique-a-breakthrough-in-human-genome-reconstruction