三代测序那些事儿（第二期）

上期和大家分享了几个三代测序技术在基因组组装中的应用案例，无论是在大型的基因组组装项目亚洲人基因组计划、还是在复杂致病菌基因组(痢疾杆菌、幽门螺杆菌等)测序项目中，三代测序技术 PacBio SMRT 均有着不俗的表现。

这期，小编将结合几篇文献为大家盘点那些使PacBio SMRT迅速崛起的特殊能力。

NO.1 单分子测序

能力描述：

首先要提到的是PacBio SMRT测序平台PacBio RSII的单分子测序能力，这在其他的两个三代测序平台 HeliScope & MinION 也有所体现，这也成了三代测序区分于二代测序的一个标志性特征。

HeliScope 是 Helicos 公司于2008年推出的全球第一台三代测序平台，但由于读长(35bp)、售价等原因在推出后的几年内便惨淡退出测序市场，Helicos公司也于2012年申请了破产保护。 Oxford Nanopore 公司的便携式纳米孔测序 ( Nanopore Sequencing ) 仪MinION目前还处于早期的客户测试阶段，首批测试数据的平均读长已达到了5.4kb，还是有较好的市场潜力。

单分子测序过程通常无须PCR(二代测序中为了将目的荧光信号从背景荧光中区分出来，测序前需要对单条模板链PCR成簇，以放大检测信号)过程，避免了二代测序常遇到的GC偏好性 ( GC bias ) 问题，因此 PacBio RSII 所产生的数据具有极低的GC偏好性，这种数据对于组装高GC基因组或者基因组中高GC区域是非常有利的。

另外, PacBio RSII 单分子测序的特点也使该平台在碱基读取 ( base calling ) 过程中不会出现二代测序平台常遇到的移相(dephasing)问题，所产生的数据更加准确，目前 PacBio RSII 所产生的数据一致性准确率 ( consensus accuracy ) 可达99.99%，如果使用新型一致性算法Quiver，一致性准确率可进一步提高至99.9999%。

相关案例：

1)PacBio SMRT组装高GC基因组相关案例：

Advantages of Single-Molecule Real-Time Sequencing in High-GC Content Genomes

韩国极地研究所研究团队使用 PacBio RS ( Pacibo RSII 早期型号)平台对一株分离与南极乔治王子岛的 Streptomyces 菌株进行了测序，该菌株基因组 GC 含量高达 71%，之前使用 200X 的 Hiseq 2000 数据进行过组装，仍没有获得完整的基因组，组装产生了185 个 contigs ， 随后使用 Sanger 法也仍然无法有效填补。随后研究人员使用仅15 X 的 PacBio SMRT 数据 ( CCS reads + long reads ) 就得到了26个 contig 的组装结果，与二代组装结果比较，发现，二代组装结果中大多数难以填补的Gap多为一些高 GC 区域。

2)PacBio SMRT组装基因组中高GC区域相关案例：

Resolving the complexity of the human genome using single-molecule sequencing

同样地，华盛顿大学的研究团队使用 PacBioRSII 平台对一个人类葡萄胎基因组 （ CHM1 ) 进行了测序，将测序数据 mapping 回人类参考基因组 GRCh37 上，在 GRCh37 GAP区域进行了局部组装 ( local assembly ) ，该研究填补和缩小了人类参考基因组 GRCh37 上接近100个 Gap，这些 GAP 大部分处于高 GC 和重复区域，其中包括一些重要基因表达调控元件。

能力小结：

上述两个案例再次证明了，PacBio RSII平台所产生的极低GC偏好性的数据在高GC基因组或高GC区域的组装中确实有着显著的优势。

对PacBio RSII实现单分子测序的技术原理感兴趣的小伙伴可阅读Stephen Turner ( PacBio 公司创始人 ) 等人在2003年发表在 Science 上一篇关于 ZMWs 的经典文献：

1. W. Turner, et al. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentrations. Science. 2003

NO.2 超长读长(super long-read)

能力描述：

吸取了Helicos公司在三代测序平台开发上的失败经验，PacBio公司在单分子测序的基础上又进一步开发了一套使其三代测序平台 PacBio RSII 更加完美的长读取技术，主要是利用了一种将荧光染料标记于磷酸链末端的dNTP作为边合成边测序(Sequencing by synthesis ) 时的反应底物，聚合反应时，荧光基团可随着焦磷酸基团被DNA聚合酶自然切除，无需其他化学试剂洗脱，最大限度保护了DNA聚合酶活性。

基于该技术，PacBio RSII使用最新的P6C4试剂使测序平均读长由原来的P5C3的8.5 kb 又进一步提高到了10kb-15kb，而早在2005年就诞生的第二代测序技术的读长水平目前还徘徊在数百bp。

PacBio RSII 目前的平均读长(10-15kb)超过了大部分细菌基因组中最大重复区域长度 & 一些小基因组大小(部分病毒基因组、动物线粒体基因组、大部分质粒) & 普通转录本长度。因此，无论是在对于基因组的组装，还是对于转录组的Isoform识别，PacBio SMRT均有着其他测序技术无法比拟的优势。

相关案例：

1)PacBio SMRT在高重复高杂合基因组组装中的应用案例：

杜仲基因组是一种高重复高杂合的基因组，杂合率>1%，重复序列在66%以上，为了解决这类复杂基因组的组装，未来组生物使用了10X PacBio SMRT 长度数据，通过新开发的组装流程，结合第二代测序数据，使得Scaffold N50达到932kb(第二代测序组装对于解决复杂基因组组装存在一定的瓶颈，一般会导致Scaffold N50 小于300kb)，这一成果也在去年的《杜仲全基因组测序重要研究成果》北京新闻发布会上进行了展示。

能力小结：

除过基因组组装外，Pacbio SMRT 也被应用于转录组测序中，由于超长的读长能够使其直接读取完整转录本，无需拼装，该技术已被应用于可变剪辑、基因融合、lncRNA 等转录组分析，从2013年至今，已有数十篇该类文献发表，小编挑了一些比较有代表性的供大家参考。

[1]Sharon, D. et al. A single-molecule long-read survey of the human transcriptome . Nature Biotechnology. 2013.

[2] Tilnger, H. et al. Defining a personal ,allele-specific,and single molecule long-read transcriptome. PNAS. 2014.

[3] Zhang, W. et al. PacBio sequencing of gene families — A case study with wheat gluten genes . Gene . 2014.

NO.3 碱基合成动力学信息记录

能力描述：

PacBio SMRT采用新型的核苷酸荧光标记技术，实现了边合成边测序(Sequencing by Synthesis)过程聚合反应的连续进行，PacBio的工程师们使用了一台内置有帧率100HZ的电子倍增CCD(EMCCD)相机的共聚焦荧光显微系统实现了对这一过程的实时(Real-time)监测，因此Pacbio RSII 在记录碱基先后顺序的同时也记录下了碱基渗入模板链的速度(碱基合成的动力学信息)，DNA聚合酶在甲基化修饰或者磷硫修饰位点处反应速度有所降低，在合成动力学信息中，则表现为荧光脉冲信号的延迟(increased interpluse duration，IPD )。基于此原理，PacBio RSII在DNA序列测定的同时获得了其甲基化修饰位点信息。

相关案例：

1)PacBio SMRT在甲基化修饰位点检测中的应用：

Genome-wide mapping of methylated adenine residues in pathogenic Escherichia coli using single-molecule real-time sequencing

布莱根妇女医院(Brigham and Women’s Hospital,BWH)等机构的研究人员利用了PacBio SMRT测序技术对溶血性尿毒病原菌E.coli O104：H4基因组中的化学修饰位点进行了测定(190X测序数据)，分析了基因组中的5mC与6mA修饰，由此绘制了全球首张致病菌全基因组水平甲基化修饰位点图谱。

2)PacBio SMRT在磷硫修饰位点检测中的应用：

Genomic mapping of phosphorothioates reveals partial modification of short consensus sequences

来自上海交通大学的研究团队利用 Pacbio RSII 对大肠杆菌基因组中的磷硫酰化修饰(PT)位点进行了测定，绘制了全球首张细菌全基因组水平磷硫酰化修饰(PT)位点图谱。

能力小结：

DNA化学修饰位点检测是表观遗传学研究的重要内容，基于PacBio SMRT 的 DNA化学修饰位点检测技术操作更加简单(无需重亚硫酸盐处理)、表观修饰检测类型更加多样、准确性更高等优点。

小编还意犹未尽，但限于篇幅，今天只能到这里了，下期接着聊。下期将为大家聊那些为三代而生的算法们，敬请关注!

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